齐墩果酸线粒体靶向脂质体的制备及抗胰腺癌研究

谭晓柯，武香香，曾华辉，朱鑫*（. 河南中医药大学药学院，郑州 450046；. 河南中医药大学中医药科学院，郑州 450046）

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一种难治性恶性肿瘤[1]，预后非常差，通常在确诊后，只有24%的人存活1年，9%的人存活5年[2]。预后不良的主要原因是缺乏早期症状、肿瘤进展迅速以及局部/转移性疾病的有效药物疗效有限[3]。

齐墩果酸（oleanolic acid，OA）是一种五环三萜类天然产物，广泛存在于多种中药材中，如三七、怀牛膝、甘草、石斛夹竹桃和女贞等[4]。研究发现，OA 具有多种有益的药理学活性，比如抗氧化作用、抗炎作用、降糖作用、抗病毒作用、肝功能保护作用、胃黏膜保护作用、抗微生物作用、抗肿瘤作用等[5]。虽然OA 具有一定的抗肿瘤活性，能够抑制多种肿瘤细胞的增殖[6]，但该药物的水溶性较差，在水中的溶解度仅为 1µg·mL-1，肠黏膜透过性较差且具有较大的首过效应，致使其生物利用度低且个体间差异较大，这些性质限制了其临床应用与开发[7]。目前，OA 在市场上销售的药物制剂只有片剂和胶囊剂，国内外有关学者进行了OA 新剂型的研究，大多数新型制剂制备工艺较复杂，载药量低，对设备要求较高，而且存在靶向性较低的问题，使药物疗效不佳以及易产生不良反应[8]。因此，我们需要开发基于脂质体的靶向性制剂来提高OA 的治疗效果，并减少毒副作用。

α-生育酚琥珀酸酯（α-TOS）是维生素E最主要的成分α-生育酚（α-TOH）的一种酯化衍生物。维生素E 在储存和应用过程中易被氧化，因而常将其酯化衍生物作为商业的供应形式，α-TOS 即是其中的一种[9]。近年来研究发现，α-TOS 除作为维生素E 的供应前体外，还具有广泛的抗肿瘤活性，可通过多种机制发挥抗肿瘤作用，如诱导细胞凋亡、抑制NF-кB 功能、抑制血管生成等。此外，α-TOS 能选择性杀死肿瘤细胞而对正常组织无不良反应[10]。三苯基磷基团（TPP）中含有3 个苯基，使得整个分子具有很强的脂溶性，同时TPP 中磷原子上的正电荷可以离域到3 个苯环上，在更大空间分散正电荷，降低扩散渗透膜时的自由能，促使TPP 穿越磷脂膜。正常细胞的线粒体膜电位为-（130 ～150）mV，远高于内质网、核糖体等细胞器的膜电位，因此亲脂性阳离子可以很容易地通过脂质双分子层的疏水屏障并在线粒体中积聚。此外，肿瘤细胞较正常细胞具有更高的线粒体膜电位（大约为200 mV），可将抗肿瘤药物优先靶向肿瘤细胞的线粒体，诱导肿瘤细胞凋亡[11]。因此，通过亲脂性阳离子对抗肿瘤药物进行修饰，可以实现将药物递送至线粒体的目的。

因此，本研究通过TPP 修饰α-TOS 构成具有线粒体靶向能力的三苯基磷基生育酚琥珀酸酯（α-TOS-TPP）偶联物作为线粒体靶向载体，以期通过静电作用使药物更容易富集于肿瘤细胞线粒体。此外脂质体表面修饰聚乙二醇（PEG）可使脂质体清除速率减慢，延长其在血液中的循环时间，提高OA 的生物利用度，进而提高其抗肿瘤活性。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；手动挤压器（型号：HE8433 Genizer 公司）；粒径分析仪（型号：250144，Brookhaven Instruments）；高倍显微镜（型号：TS100，Nikon）；万分之一电子天平（型号：AL204，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；透射电子显微镜[型号：JEM-1230（HC）]；UV-2201 紫外分光光度计（日本岛津公司）；全波长酶标仪（Multiskan GO）；激光共聚焦显微镜（德国，ZEISS）；流式细胞仪（美国贝克曼）。

1.2 试药

α-TOS（阿拉丁，批号：T109349，纯度＞98%）；6-溴正己醇（阿拉丁，批号：B138834，纯度＞97%）； 三苯基膦（阿拉丁， 批号：T104475，纯度＞99.0%）；大豆卵磷脂（阿拉丁，批号：B1504087，纯度＞98%）；胆固醇（北京百灵威科技有限公司，批号：LK40Q28，纯度：95%）；PEG（SIGMA，批号：BCBQ6878V）；二甲基亚砜（Solarbio，批号：710N032，细胞培养级）；香豆素6（阿拉丁，批号：12009083，纯度＞98.0%）；Mito-Tracker Red（Beyotime， 批号：062320210302）；DAPI 溶液（Solarbio，批号：20190923）；Annexin V-FITC/PI apoptosis kid 凋亡试剂盒（联科生物，批号：A11015）；其他试剂均为分析纯。

1.3 细胞

胰腺癌BxPC-3 细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 α-TOS-TPP 的合成

将α-TOS（5.0000 g，9.4201 mmol）、6-溴正己醇（1938.3 µL，14.1302 mmol）、二环己基碳二亚胺（2.3307 g，11.3041 mmol）、4-二甲基吡啶（0.0575 g，0.4710 mmol）分别用适量二氯甲烷溶解后，在冰浴条件下，将其混合，搅拌10 min 后转至室温，再搅拌12 h 后加入6-溴正己醇（646.1 µL，4.7101 mmol），继续搅拌12 h[12]。通过柱层析分离收集，初始展开剂为石油醚-乙酸乙酯（24∶1），之后适当改变比例增大极性，收集的预测产物在真空管干燥箱60 ℃下减压干燥5 h，得到无色或浅黄色油状物化合物A，收率为64.56%。经核磁验证，如图1所示。

取化合物A（3.0769 mmol，2.1349 g）、三苯基膦（6.1538 mmol，1.6141 g）、无水K2CO3（0.3000 g）在适量乙腈中混合，90℃ 回流 30 h[12]。过滤除去K2CO3后，浓缩滤液，加入石油醚超声，过滤除去滤液，不溶物经柱层析，初始展开剂为乙酸乙酯-甲醇（20∶1），之后适当改变比例增大极性，收集的预测产物在真空管干燥箱60℃ 下减压干燥5 h，得到无色或浅黄色油状物化合物B，收率为46%，纯度为98.53%。经核磁验证，如图2所示。

通过1H-NMR 对化合物A 和B 进行了表征。在化合物A 的1H-NMR 谱中，在δ＝4.11 ～4.14（2H）和3.37 ～3.41（2H）处出现的三重峰，在δ＝1.84 ～1.91（2H），1.78 ～1.86（2H），1.74 ～1.81（2H），1.64 ～1.71（2H）处出现的多重峰证实了6-溴正己醇通过酯键与α-TOS 连接。δ＝2.92 ～2.95（2H）、2.75 ～2.80（2H）、2.58 ～2.64（2H）处存在三重峰和代表单线态峰，δ＝2.09（3H）、2.02（3H）、1.98（3H）证实了α-TOS 部分的存在，如图1。在化合物B 的1H-NMR 谱中，δ＝7.6 ～7.9（15H）证实了苯基的存在，剩余特征质子峰与化合物A 位置相同，如图2。经验证化合物B 为α-TOS-TPP。

图1 化合物A 的氢核磁谱图Fig 1 1H-NMR spectrum of compound A

图2 化合物α-TOS-TPP 的氢核磁谱图Fig 2 1H-NMR spectrum of compound α-TOS-TPP

2.2 α-TOS-TPP-OA 的制备

精密称取5.0 mg 卵磷脂，10.0 mgα-TOSTPP，1.0 mg OA，1.0 mg 胆固醇，PEG 1.0 mg（1∶2∶0.2∶0.2∶0.2）分别溶于2.0 mL 的二氯甲烷中，混合上述溶液，20 r·min-1、40 ℃下旋转蒸发除去二氯甲烷，40 ℃真空干燥2 h 以彻底除去有机溶剂，加入去离子无菌水2.0 mL，60℃下磁力搅拌水化2 h，250 W 水浴超声5 min，在60℃下依次挤压通过200 nm、100 nm 聚碳酸酯膜，即得α-TOS-TPP-OA，在4℃下储存备用[13]。

2.3 形态、粒径和电位

在室温下采用粒径分析仪对制备的脂质体的粒径与多分散系数（PDI）进行表征，结果平均粒径为（137.0±0.82）nm，PDI 为（0.23±0.01），PDI 的值较大，可能是因为挤压膜时聚碳酸酯膜的孔径大小不一所造成的，如图3A 所示。使用α-TOS 制备的α-TOS-OA，测得其Zeta 电位为-（31.9±0.97）mV， 将α-TOS 换成α-TOSTPP 后制备的α-TOS-TPP-OA 的Zeta 电位为+（43.09±1.22）mV，Zeta 电位由负电荷转变为正电荷，见图3B，说明TPP 可分散在脂质体表面，使其具有线粒体靶向的能力，与预期一致。采用高倍透射电子显微镜观察α-TOS-TPP-OA 的形貌，形态见图3C ～3E。由电镜照片可以观察到，脂质体单分散，呈球形，粒度较均一，其结果与粒径仪所测到的脂质体粒径相吻合。

图3 α-TOS-TPP-OA 的粒径分布（A）、Zeta 电位及透射电子显微镜图（C ～E）Fig 3 Particle size distribution（A），Zeta potential（B），and transmission electrons（C ～E）of α-TOS-TPP-OA microscope picture

2.4 包封率和载药量的测定

2.4.1α-TOS-TPP 标准曲线的建立 配制质量浓度为10、30、50、80、120 和150 μg·mL-1的溶液，通过紫外可见光分光光度计在λ＝287 nm 检测溶液的吸光度。以吸光度（y）对质量浓度（x）进行线性拟合，得到回归方程y＝10.082x+0.1995，R2＝0.997，表明α-TOS-TPP在10 ～150 μg·mL-1内与吸光度线性关系良好。

2.4.2 OA 标准曲线的建立 采用高效液相色谱法（HPLC）测定OA 的含量。采用ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-1%醋酸水（90∶10，V/V）；柱温：25℃；流速：1.0 mL·min-1；波长：220 nm；进样量：20 μL。配制质量浓度为10、50、80、100、150、200和300 μg·mL-1的OA 溶液，进样测定，以峰面积（y）对质量浓度（x）进行线性拟合，得回归方程y＝5495.8x-34.366，R2＝0.9991，表明OA在10 ～300 μg·mL-1内与峰面积线性关系良好。

取1.0 mLα-TOS-TPP-OA 溶液置于超滤离心管内（截留相对分子质量为30 000），以4000 r·min-1离心30 min，分离溶液中游离的OA 及α-TOS-TPP，截留在离心管内的为α-TOS-TPPOA，离心管内加入5 倍体积的甲醇破坏脂质体结构，促使OA 和α-TOS-TPP 从胶束中释放出来，采用HPLC 测定脂质体中包封的OA 质量，离心管外为游离的OA，采用同样的方法可测定游离的OA 的质量。α-TOS-TPP 的含量则通过紫外可见光分光光度计在λ＝287 nm 检测；用以下公式计算包封率和载药量：

包封率＝脂质体内包封的药物质量/(脂质体内包封的药物质量+未包封的游离药物质量)×100%

载药量＝包封于脂质体内的药物质量/(载体的质量+脂质体包封的药物总质量)×100%经计算得到α-TOS-TPP 的包封率和载药量分别为（76.21±7.74）%和（39.06±5.51）%，OA的包封率和载药量分别为（70.96±9.13）%和（3.90±0.75）%。

2.5 脂质体的稳定性

将α-TOS-TPP-OA 分别在4℃纯水中和37℃的PBS 环境中分别存放7 d 和3 d，模仿存储环境和体内环境，检测其粒径及PDI 变化。如图4所示，在4℃的纯水下储存7 d 后粒径从（137.0±0.82）nm 变为（131.1±0.80）nm，PDI 从（0.227±0.005）变为（0.248±0.009）。在37℃的PBS 储存3 d 后，粒径增加到（176.7±3.9）nm，PDI 则变为（0.257±0.013）。由此表明，该脂质体在4℃的纯水中有良好的储存稳定性，且在37℃的PBS 中也有较好的稳定性（见图4）。

图4 α-TOS-TPP-OA 的稳定性Fig 4 Stability of α-TOS-TPP-OA

2.6 线粒体靶向

由于OA 自身不发荧光，因此采用脂溶性的带绿色荧光的香豆素6 作为替代OA 的模型药物，按“2.1”“2.2”项下方法制备含有香豆素6（C6）的脂质体。将BxPC-3 细胞以1×104个的密度接种于24 孔培养板内，用血清培养基培养24 h，将质量浓度为100 ng·mL-1的载C6（显绿色荧光）的α-TOS-C6 和载C6 的α-TOS-TPP-C6 加入其中，再与细胞共同孵育1、3 h 后，用37 ℃的PBS 洗涤。用100 nmol·L-1的Mitotracker Red染线粒体（红色荧光）20 min，10 μg·mL-1的DAPI 溶液染细胞核（蓝色荧光）5 min，然后在激光共聚焦显微镜下观察C6 在细胞内的分布情况。

结果如图5所示，孵育1、3 h 后，含有C6的脂质体进入肿瘤细胞，且随着孵育时间的延长，绿色荧光逐渐增强，表明随着孵育时间的延长，肿瘤细胞对脂质体的摄取增加。带有绿色荧光的脂质体与呈红色荧光的线粒体重合，会呈现为黄色。随着孵育时间的增加黄色逐渐变深，说明脂质体逐步聚集在线粒体周围。脂质体与线粒体的共定位通过皮尔逊系数（PCC）来体现，通过Image J 分析的到共定位散点图及PCC。通过共定位散点图表明，随着孵育时间的增加，α-TOS-TPP-C6 的红色荧光和绿色荧光共定位关系明显好于α-TOS-C6。PCC 结果如图6显示，α-TOS-TPP-C6 的PCC 明显高于α-TOS-C6，且存在显著性差异。由此可知，TPP 阳离子能促进脂质体聚集在肿瘤细胞的线粒体部位。

图5 α-TOS-C6 和α-TOS-TPP-C6 孵育1、3 h 后激光共聚焦显微镜图片及共定位散点图Fig 5 Confocal laser confocal microscopy images and colocalization scatter plots of α-TOS-C6 and α-TOS-TPP-C6 after incubation for 1 and 3 h

图6 α-TOS-C6 和α-TOS-TPP-C6 孵育1、3 h 后的PCC 值（ ±s，n ＝3）Fig 6 PCC of α-TOS-C6 and α-TOS-TPP-C6 after 1 and 3 h incubation（x±s，n ＝3）

2.7 细胞存活率的测定

将胰腺癌细胞株BxPC-3 复苏传代，在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，然后分为OA 组、α-TOS-TPP 组、α-TOS-TPP+OA 组和α-TOS-TPPOA 组，给予对应药物处理，由于不同给药组在相同浓度时的抑制率相差较大，在计算IC50时容易造成误差，故给药浓度有所不同。其中α-TOSTPP+OA 游离药物组和α-TOS-TPP-OA 组的给药浓度为1、2、5、10、15、20、25、30 µmol·L-1（以OA 浓度为准），OA 组、α-TOS 组和α-TOSTPP 组给药浓度为15、20、25、30、35、40、45、50 µmol·L-1，每个浓度设6 个复孔，加药后孵育48 h 后，取出96 孔板，避光条件下加入MTT溶液20 µL，继续培养4 h 后取出，加入150 µL 二甲基亚砜，轻微振荡10 min，在490 nm 波长下检测下吸光度，计算IC50。

结果如表1所示，通过TPP 对α-TOS 的修饰，α-TOS-TPP 对BxPC-3 的抑制作用较α-TOS 明显增加。α-TOS-TPP+OA 给药组合对BxPC-3 的抑制作用高于α-TOS-TPP 和OA 单独给药。而α-TOSTPP-OA 对BxPC-3 的毒性高于α-TOS-TPP+OA的给药组合，其IC50明显低于其他给药组。

表1 OA、α-TOS-TPP、α-TOS-TPP+OA 游离药物和α-TOSTPP-OA 在48 h 的IC50Tab 1 IC50 of OA，α-TOS-TPP，α-TOS-TPP+OA free drugs and α-TOS-TPP-OA at 48 h

2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡

为检测α-TOS-TPP-OA 诱导BxPC-3 细胞凋亡的作用，将BxPC-3 细胞以2×106个每孔加入6孔板中，孵育过夜贴壁。孔内分别加入相应IC50的α-TOS-TPP-OA，其中OA、α-TOS、α-TOS-TPP和α-TOS-TPP+OA 的加入量与α-TOS-TPP-OA中相应含量相等。孵育24 h 后，分别收集孔中的细胞，PBS 洗涤两次后，加入5 µL Annexin V-FITC和10 µL PI 标记。通过流式细胞仪分析凋亡情况。如图7所示，α-TOS-TPP-OA 处理的细胞处于早期和晚期凋亡阶段的分别占45.34%和37.55%，而α-TOS-TPP+OA 分别诱导46.74%和5.73%的细胞进入早期和晚期凋亡阶段。从流式细胞仪分析可以看出，α-TOS-TPP-OA 比α-TOS-TPP+OA 能诱导更多的BxPC-3 细胞凋亡，可能是因为靶向作用让更多的药物进入线粒体所致。

图7 流式细胞仪分析OA、α-TOS、α-TOS-TPP、α-TOS-TPP +OA 和α-TOS-TPP-OA 诱导BxPC-3 细胞凋亡的作用Fig 7 Apoptosis of BxPC-3 cells induced by OA，α-TOS，α-TOSTPP，α-TOS-TPP+OA and α-TOS-TPP-OA by flow cytometry

3 讨论

OA 具有潜在的抗肿瘤活性，可诱导许多肿瘤细胞系凋亡，但OA 的低水溶性和低渗透性限制了其使用[14]。因此，有必要选择合适的纳米给药系统来增加OA 的溶解度，减少口服首过效应，提高生物利用度。近年来，为了克服低溶解度药物的缺点，目前已有脂质体[15]、纳米脂质体[16]、纳米混悬剂[17]、口服微乳[18]、固体分散体[19]等剂型的报道，但存在长期稳定性差、载药量小、靶向性多、仅依靠通透性保留（EPR）效应的被动靶向等不足。

α-TOS 能与线粒体电子传递链复合物Ⅱ结合，通过线粒体外膜通透性诱导不同类型肿瘤细胞凋亡，从而损伤线粒体[20]。Mallick 等[13]证明了α-TOS-化疗药物偶联脂质体可以同时靶向肿瘤细胞中的线粒体和细胞核。本研究通过酯化反应将6-溴正己醇连接到α-TOS 上，该反应生成化合物A，进一步引入线粒体靶向TPP 基团，得到α-TOS-TPP。α-TOS-TPP 具有一定的亲脂性，更容易透过细胞膜，而且肿瘤细胞中的线粒体具有更高的膜电位，使得α-TOS-TPP 这种离域型亲脂阳离子（DLC）更容易选择性富集肿瘤细胞线粒体，因此使其一定程度上具有了线粒体靶向的能力[21]。

以α-TOS-TPP 作为线粒体靶向载体，制备了具有线粒体靶向性的OA 脂质体，并且使用PEG对脂质体进行表面包覆，以避开单核吞噬系统，以确保长时间的血液循环。粒径的大小是通过独特的渗漏血管系统成功积聚到肿瘤组织中的重要决定因素之一，经证实，粒径为20 ～300 nm 的胶束的血液循环时间和肿瘤聚集量随其直径的增大而增加，最佳粒径范围为100 ～160 nm[22]。该脂质体的粒径为（137.0±0.8）nm，可通过增强EPR 效应和减少网状内皮系统（RES）的清除提高抗肿瘤效果和降低毒性[23]。此外，α-TOSTPP-OA 的表面电荷为+（43.09±1.22）mV，说明TPP 覆盖在脂质体的表面，使得该脂质体表面带有正电荷，这可以使该脂质体通过胞吞进入细胞内后依靠静电效应向线粒体聚集，通过线粒体靶向性考察，证实了这一点。通过MTT 实验和流式细胞仪分析发现，α-TOS-TPP-OA 对 BxPC-3细胞的抑制作用明显增强，这可能与α-TOS-TPPOA 增加了药物在线粒体的聚集有关。

综上所述，本研究通过TPP 对α-TOS 的修饰，合成了一种具有线粒体靶向性的载体，制备了搭载OA 的脂质体，并初步评价了其体外抗胰腺癌作用，为OA 治疗胰腺癌提供了一种新的思路，但后续还需要更深入地开展细胞水平研究及动物体内实验对本结论进一步验证。