重楼皂苷H诱导耐替莫唑胺胶质瘤SHG44R细胞凋亡和焦亡的作用研究

孙光强，薛玉叶，陆云阳，杜洋，王媛媛，方菲，纪玉强，程光，汤海峰，*，邱鹏程*

（1. 陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；2. 空军特色医学中心药剂科，北京 100142；3. 空军军医大学药学系中药与天然药物学教研室，西安 710032；4. 西安市第一医院中心实验室，西安 710002；5. 空军军医大学西京医院神经外科，西安 710032）

胶质瘤是中枢性恶性肿瘤的一种，目前临床上主要采用手术联合放化疗治疗，但患者对其一线化疗药物替莫唑胺的耐药问题不容忽视[1]。同时，胶质瘤具有四高一低的发病特点，即高发病率、高复发率、高死亡率、高致残率和低治愈率[2]。因此，寻找一种新型的胶质瘤的化疗药物具有十分重要的意义。

细胞焦亡（pyroptosis）是一种细胞炎性程序性死亡方式，主要通过炎症小体介导包含caspase-1 在内的多种caspase 蛋白的激活，造成包括GSDMD 在内的多种Gasdermin 家族成员发生剪切和多聚化，造成细胞穿孔，进而引起细胞死亡[3-4]。相比于凋亡（apoptosis），焦亡发生更快，并伴随着大量促炎症因子的释放[5]。大量的证据表明细胞焦亡能够影响肿瘤的发展，可作为潜在的肿瘤治疗策略，为患者开发基于焦亡的新药提供思路[6]。

重楼皂苷H（结构式见图1，paris saponin H，PSH）属于偏诺皂苷元型甾体皂苷，在百合科重楼属多种植物中大量存在，本课题组先后从川产南重楼和陕产具柄重楼、狭叶重楼、云南重楼中分离鉴定了该化合物。据报道，PSH 具有抗肿瘤、抗炎、抗凝等作用[7-8]。课题组前期研究发现PSH 通过A1 和A3 腺苷受体途径，抑制胶质瘤U251 细胞增殖[9]，但其对耐替莫唑胺胶质瘤的作用机制研究尚无报道，尤其未见其诱导细胞焦亡的报道。故本研究基于细胞凋亡和焦亡对PSH 抗耐药胶质瘤机制进行初步探讨。

图1 重楼皂苷H 的化学结构式Fig 1 Chemical structure of paris saponin H

1 材料

1.1 细胞来源

耐替莫唑胺胶质瘤SHG44R 细胞株由本课题组前期研究建立成功[10]。

1.2 仪器

超净工作台（Thermo Fisher），CO2恒温培养箱（ESCO 公司），倒置显微镜（Olympus），血球计数板（上海市求精生化试剂仪器有限公司），Multiskan FC 酶标仪（赛默飞公司），流式细胞仪（BD FACSCalibur），透射电子显微镜（JEOL，JEM-1400），电泳系统（Bio-Rad），凝胶成像系统（Bio-Rad）， 荧光定量PCR 仪（BIONEER，Exicycler 96）， 紫外分光光度计（Thermo，NANO 2000），真空干燥箱（SYSBERY 公司），微量移液器（BIOHIT 公司，Proline），超纯水系统（Heal 公司，NW10LVF），超速冷冻离心机（湖南湘仪公司）。

1.3 试药

重楼皂苷H（宝鸡翊瑞生物科技有限公司，纯度：99.45%，批号：JOT-11279），CCK-8 试剂盒（Elabscience，批号：E-CK-A362），Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒（BD，批号：556547），DMEM 培养基（Gibco，批号：11965092），胎牛血清（Biological Industries，批号：04-121-1A），胰蛋白酶（Solarbio，批号：T1300），青链霉素混合液（Solarbio，批号：P1400），Cleaved-caspase-1 抗体（Cell Signaling Technology，批号：4199T）、N-GSDMD 抗体（abcam，批号：ab215203）、Cleavedcaspase-3 抗体（批号：19677-1-AP）、Bax 抗体（批号：50599-2-AP）、Bcl-2 抗体（批号：12789-1-AP）、IL-1β抗体（批号：16806-1-AP）、IL-18 抗体（批号：10663-1-AP）、NLRP3 抗体（批号：19771-1-AP）、β-actin 抗体（批号：20536-1-AP）（Proteintech），TRIpure（BioTeke，批号：RP1001），BeyoRT II M-MLV 反转录酶（碧云天，批号：D7160L），RNase inhibitor（BioTeke，批号：RP5602），2×Taq PCR MasterMix（Solarbio，批号：PC1150），SYBR Green（Solarbio，批号：SY1020），其他试剂均为国产分析纯，引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

2 方法

2.1 细胞培养

将SHG44R 细胞培养于含10%胎牛血清，1%青链霉素混合液的DMEM 高糖培养基中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，取对数生长期且状态良好的细胞用于后续实验。

2.2 CCK-8 法检测细胞活力

取对数生长期的SHG44R 细胞接种于96 孔板中。待细胞贴壁后，加入不同浓度用DMSO 配制的PSH，培养不同时间后，弃上清液，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育2 h，用酶标仪在450 nm 波长下测量各孔的吸光度（OD）值，计算细胞存活率。

2.3 透射电子显微镜观察细胞形态变化

取对数生长期的SHG44R 细胞，PBS 洗涤，加入6 μg·mL-1的PSH，培养24 h 后收集细胞，用2%戊二醛溶液固定2 h，随后PBS 洗涤2 次，每次10 min。然后在1% 四氧化锇溶液中固定2 h。用乙醇梯度脱水后，将细胞包埋在环氧树脂中并切成 50 ～60 nm 的切片。切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。透射电子显微镜分析切割样品。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期的SHG44R 细胞，接种于6 孔板中，待细胞完全贴壁后，加入不同质量浓度的PSH（6、12 μg·mL-1）处理24 h。收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI 双染色细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡双染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.5 Western blot 法检测凋亡相关蛋白表达

将细胞消化后接种于6 孔板中，待细胞贴壁后，加入不同质量浓度的PSH（6、12 μg·mL-1）处理细胞24 h。收集细胞制备蛋白样品，10%聚丙烯胺-SDS 凝胶电泳后转至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，PBST 洗3 次，加入二抗室温孵育1 h，PBST 洗3 次。加入ECL 化学发光液后放入全自动化学发光图像分析系统中曝光。

2.6 RT-qPCR 检测焦亡相关mRNA 表达

取对数生长期的SHG44R 细胞，接种于6 孔板中，待细胞完全贴壁后，加入3 μg·mL-1的PSH 处理24 h。收集细胞，加入Trizol 试剂提取总RNA。反转录制备cDNA，除去培养基，PBS 洗1次，除去PBS，每组加入1 mL Trizol 后放置于冰面，轻摇使Trizol 试剂充分接触5 min。RT-qPCR检测PSH 给药组（3 μg·mL-1）与对照组SHG44R细胞caspase-1、caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18、NLRP3的mRNA 的表达，采用2-△△CT法计算mRNA 相对表达量。

caspase-1：Forward，ATTACAGACAAGGGTGCT；Reverse，CTTTCGGAATAACGGAGT；

caspase-11：Forward，GCACAATGGGCTCTATCT；Reverse，CAGTCGTTCTATGGTGGG；

GSDMD：Forward，GGTTAGGAAGCCCTCAAGC；Reverse，CATGGCATCGTAGAAGTGG；

IL-1β：Forward，TATTACAGTGGCAATGAGG；Reverse，ATGAAGGGAAAGAAGGTG；

IL-18：Forward，ATAGCCAGCCTAGAGGTA；Reverse，ATCAGGAGGATTCATTTC；

NLRP3：Forward，CCCCGTGAGTCCCATTA；Reverse，GACGCCCAGTCCAACAT；

β-actin：Forward，GGCACCCAGCACAATGAA；Reverse，TAGAAGCATTTGCGGTGG。

2.7 统计分析

所有统计分析均采用Graphpad prism 8 软件完成，数据以±s表示，组间差异通过单因素方差分析检验（One-way ANOVA），P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 PSH 对耐替莫唑胺胶质瘤SHG44R 细胞活力的影响

采用CCK-8 法检测不同剂量PSH 处理24、48、72 h 对细胞存活率的影响，结果表明PSH抑制SHG44R 细胞增殖具有时间和剂量依赖性。PSH 在24 h 对SHG44R 的IC50＝6.986 μg·mL-1，见图2。

图2 PSH 对SHG44R 细胞活力的影响Fig 2 Effect of PSH on the cell viability of SHG44R cells

3.2 PSH 对耐替莫唑胺胶质瘤SHG44R 细胞形态学影响

如图3所示，与正常组相比，PSH 组出现核染色质固缩、核膜皱褶，细胞器集中，出现凋亡小体，表明PSH 可诱导细胞凋亡。此外，细胞内容物渗漏，细胞膜有轻微损伤，提示PSH 可能诱导耐替莫唑胺胶质瘤细胞焦亡。

图3 PSH 对SHG44R 细胞形态学影响Fig 3 Effect of PSH on the cell morphology of SHG44R cells

3.3 PSH 诱导耐替莫唑胺胶质瘤SHG44R 细胞凋亡

为了进一步证实PSH 介导耐替莫唑胺胶质瘤SHG44R 细胞凋亡，采用流式细胞术检测给予PSH 后细胞凋亡率的变化。结果表明PSH 呈剂量依赖性地诱导细胞凋亡（见图4）。

图4 PSH 对SHG44R 细胞凋亡的影响（n ＝3）Fig 4 Effect of PSH on the cell apoptosis of SHG44R cells（n ＝3）

3.4 PSH 对耐替莫唑胺胶质瘤SHG44R 细胞凋亡的蛋白的影响

采用Western blot 法检测不同剂量PSH 处理后细胞凋亡相关蛋白的表达。结果表明，给予PSH 可使Bax、Cleaved-caspase-3 蛋白上调，Bcl-2 蛋白下调（见图5）。

图5 PSH 对SHG44R 细胞凋亡关键蛋白的影响Fig 5 Effect of PSH on the key proteins of cell apoptosis in SHG44R cells

3.5 PSH 诱导耐替莫唑胺胶质瘤SHG44R 细胞焦亡

如图6所示， 与正常组相比，PSH 组caspase-1、caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18和NLRP3 的mRNA 表达量显著增加。进一步采用Western blot 法检测不同剂量PSH 处理后细胞焦亡相关蛋白的表达。结果表明，给予PSH 使Cleaved-caspase-1、Cleaved-N-terminal-GSDMD、IL-1β、IL-18、NLRP3 蛋白上调（见图7）。蛋白表达和基因水平结果一致，说明PSH 可诱导耐替莫唑胺胶质瘤SHG44R 细胞焦亡。

图6 PSH 对SHG44R 细胞焦亡GSDMD 通路相关mRNA 表达的影响（n ＝3）Fig 6 Effect of PSH on the expression of mRNA related to the GSDMD pathway of pyroptosis of SHG44R cells（n ＝3）

图7 PSH 对SHG44R 细胞焦亡GSDMD 通路相关蛋白的影响Fig 7 Effect of PSH on GSDMD pathway pyroptosis-related proteins in SHG44R cells

4 讨论

耐药是胶质瘤临床治疗面临的重要问题。天然产物是抗肿瘤先导化合物的重要来源[11]，从中药中寻找具有抗耐药胶质瘤作用的活性成分具有重要意义。既往研究已报道重楼皂苷抗肿瘤的多种作用机制，主要包括抑制增殖、凋亡、影响迁移与侵袭、阻滞细胞周期、联合一线化疗药物辅助治疗、逆转肿瘤耐药、氧化应激、改变肿瘤细胞膜通透性、抑制胞内药物外流，抑制血管增生、诱导自噬等[7-8，12]。但关于重楼皂苷对细胞焦亡等新型细胞死亡方式的影响的报道较少。本研究结果显示，PSH 可抑制耐替莫唑胺胶质瘤SHG44R 细胞增殖，诱导SHG44R 细胞凋亡和焦亡。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，是多数重楼皂苷引起肿瘤细胞死亡的常见机制[13-14]。其中内源性通路是由促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白调节，如Bcl-2 蛋白家族蛋白[15-16]，当 Bax/Bcl-2 比值发生变化，线粒体通透性增加，线粒体破裂，促凋亡蛋白细胞色素C 将从线粒体释放到细胞质，激活下游caspase 家族[17-18]。caspase-8 和caspase-9 作为caspase 的启动子，最终激活下游凋亡执行蛋白caspase-3，通过裂解细胞底物诱导细胞凋亡。本研究结果显示，与正常组相比，重楼皂苷H 可显著上调SHG44R 细胞中凋亡相关蛋白Cleavedcaspase-3、Bax 表达水平，显著降低Bcl-2蛋白表达水平，表明重楼皂苷H 可诱导SHG44R 细胞凋亡。

细胞焦亡在体外抑制肿瘤细胞增殖和体内肿瘤生长中起着关键作用[19]。与其他细胞死亡方式相比，具有独特的形态和机制[20-21]。Gasdermin 家族蛋白是细胞焦亡的关键效应分子，其诱导细胞焦亡的机制比较明确，同时也是其经典途径[22]。一方面，在外界的刺激下，细胞内的模式识别受体（NLR）作为感受器，识别信号，通过接头蛋白ASC 与Pro-caspase-1 结合，形成多蛋白复合物，激活caspase-1，活化的caspase-1 一方面切割GSDMD，形成含有GSDM-NT 活性域的肽段，诱导细胞膜穿孔，细胞破裂，释放内容物，引起炎症反应；另一方面，活化的caspase-1 对IL-1β和IL-18 前体进行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并释放到胞外，募集炎症细胞聚集，扩大炎症反应其是由炎性小体组装介导的，伴随着GSDMD裂解及IL-1β和IL-18 的释放[23]。本研究结果显示，与正常组相比，PSH 可显著上调SHG44R 细胞中caspase-1、caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18、NLRP3 的mRNA 表达水平，同时上调Cleavedcaspase-1、Cleaved-N-terminal-GSDMD、IL-1β、IL-18 和NLRP3，表明重楼皂苷H 可诱导耐替莫唑胺胶质瘤SHG44R 细胞焦亡。

综上所述，PSH 能够抑制耐替莫唑胺胶质瘤SHG44R 细胞增殖，诱导其细胞凋亡与焦亡。