布地奈德直肠用脂质体温敏凝胶制备工艺的研究

杨东亮，马瑞丽，赵宇郁，滕亮，马桂芝*，高晓黎（. 新疆医科大学第一附属医院药学部，乌鲁木齐80054；. 新疆医科大学 药学院，乌鲁木齐 800；. 庆阳市中医医院药剂科，甘肃 庆阳 745099）

溃疡性结肠炎（UC）是结直肠的一种慢性免疫介导的炎症性疾病[1]，病因尚不明确，且暂无法治愈，如果不及时治疗，可导致黏膜损伤及结直肠癌等致命并发症[2]。在全球范围内，UC 的发病率呈上升趋势[3]，近二十余年来，我国UC的就诊人数快速增长[4]。UC 一般均以连续性分布的方式，从直肠向近端结肠扩展，在中国病变的主要部位为直肠、直-乙状结肠、左侧结肠。糖皮质激素是活动期UC 诱导缓解治疗的重要药物，临床常口服或静脉给予糖皮质激素，但全身用药易出现药物不良反应并存在诸多限制，且局部药物浓度低[5]。布地奈德（budesonide，Bud）是第二代皮质类固醇类激素，具有局部抗炎作用强，全身不良反应少的优点，可有效缓解轻中度UC 患者的症状[6]。

目前，临床常使用吸入用Bud 混悬剂灌肠[7]，但混悬剂几乎没有生物黏附性，在肠道保留时间短，且几乎不溶于水、局部吸收差，影响疗效。故本研究利用脂质体的特性增加药物溶解度、提高黏膜滞留性能、升高靶部位浓度、减少药物入血[8]；同时，利用温敏凝胶常温下为液态、体温下为凝胶的特点，促进药物的均匀分布、提高局部黏附性能，以对抗肠道的自蠕动[9-10]。本研究将Bud 制备成脂质体后再进一步制成脂质体温敏凝胶，使其兼顾脂质体和温敏凝胶的优势：给药前为液体状态，到达给药部位后均匀分布，后迅速相变为凝胶黏附于肠黏膜，进一步通过脂质体实现靶向作用，提高疗效，降低不良反应。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AD 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；New Classic MS 分析天平（梅特勒-托利多公司，d ＝0.01 mg）；KQ5200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Zetasizer Nano ZS 纳米激光粒径测定仪（英国马尔文仪器有限公司）；PS-1000 磁力搅拌器（东京理化器械株式会社）；3-18KS 台式高速冷冻离心机（SIGMA公司）；VCX500 超声波细胞破碎仪（Sonics &Materials Inc）；TP-6 智能透皮试验仪（天津市鑫洲科技有限公司）；PHSJ-3F 雷磁pH 计（上海仪电科学仪器有限公司）；NDJ-5S 数字式黏度计（上海菁海仪器有限公司）；Milli-Q 艾柯超纯水仪（美国密理博公司）。

1.2 试药

Bud 对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y13J7C9082，纯度≥ 98%）；Bud 原料药（山东泰华生物科技有限公司，批号：20190906，纯度≥ 99%）；大豆磷脂（批号：SYSO-200401）、胆固醇（批号：B80859）（上海艾伟拓医药科技有限公司）；泊洛沙姆407、泊洛沙姆188（北京索莱宝科技有限公司）；羟丙基甲基纤维素（上海麦克林生化科技有限公司）；醋酸纤维素膜（孔径：0.45 µm，尺寸：50 mm）（上海市新亚净化器件厂）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 Bud 的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-水（72∶28）为流动相等度洗脱，检测波长260 nm，进样量10µL，流速1 mL·min-1，柱温25℃。

2.1.2 溶液的配制 取Bud 对照品适量，精密称定，置25 mL 量瓶中，加甲醇超声溶解并定容，即得质量浓度为196.4 µg·mL-1的对照品储备液。精密移取对照品储备液适量，用甲醇依次稀释为0.38、0.77、1.53、3.07、6.14、12.28、24.55、49.1、98.2 µg·mL-1的系列对照品溶液。

分别取Bud 对照品溶液、Bud 脂质体、Bud脂质体温敏凝胶1.0 mL，甲醇定容，超声，以0.22 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

制备不含Bud 的空白脂质体、空白脂质体温敏凝胶，各取1.0 mL，甲醇定容，超声，以0.22 µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得阴性样品溶液。

2.1.3 专属性考察 取Bud 对照品、供试品及阴性样品溶液各10 μL，进样分析，记录色谱图，结果见图1，基质对Bud 测定无干扰[11]。

图1 Bud 脂质体及Bud 脂质体温敏凝胶的HPLC 图Fig 1 HPLC chromatogram of Bud liposomes and Bud liposome temperature sensitive gel

2.1.4 线性关系考察 测定系列对照品溶液，以峰面积（Y）对Bud 质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程Y＝1.59×104X+1.993×103（r＝0.9999）。结果表明，Bud 在0.38 ～98.2 µg·mL-1与峰面积线性关系良好。

2.1.5 方法学考察 取供试品溶液连续测定6 次，测得精密度RSD为0.30%。于常温下供试品分别放置0、2、4、6、8、10、12 h，测得稳定性RSD为1.1%。平行制备6 份供试品溶液，测得重复性RSD为1.7%。精密量取已知浓度样品9 份，加低、中、高浓度对照品溶液，测得平均加样回收率在98.7%～100.2%，RSD均＜2.0%。

2.2 Bud 脂质体的制备

2.2.1 制备工艺优选指标 以包封率、载药量和粒径作为考察指标，综合分析。结合层次分析法确定的权重系数，得到综合评分Y＝包封率/包封率最大值×0.7306+载药量/载药量最大值×0.1884+粒径最小值/粒径×0.0810[11]。

2.2.2 Bud 脂质体的制备工艺 根据Bud 性质，采用逆向蒸发法制备Bud 脂质体。精密称取Bud原料药、胆固醇和大豆磷脂适量于250 mL 圆底烧瓶中，加入20 mL 氯仿超声使其溶解，再按有机相与水相的体积比加入超纯水，水浴超声10 min形成稳定的W/O型乳液，40℃下减压蒸发除去有机溶剂，加入超纯水，继续旋转蒸发，于冰浴条件下超声，即得Bud 脂质体，于3 ～5℃保存[12]。

2.2.3 Bud 脂质体制备工艺单因素的考察 测定各脂质体包封率、载药量和粒径，以综合评分Y为指标，按“2.2.2”项下方法考察膜材比（3∶1、6∶1、9∶1、12∶1 和15∶1）、脂药比（2∶1、6∶1、10∶1、14∶1 和18∶1）、有机相与水相比例（V有机/V水相为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 和6∶1）、乳化时间（6、8、10、12 和14 min）、孵育温度（20、30、40、50 和60℃）、分散时间（10、15、20、25和30 s）等因素对Bud 脂质体综合指标的影响。结果，在膜材比为9∶1、脂药比为6∶1、V有机/V水相为4∶1、乳化时间12 min、孵育温度50 ℃、分散时间15 s 时，所制脂质体包封率较高。

2.2.4 星点设计-效应面法优化制备工艺 在单因素试验的基础上，选取脂药比和V有机/V水相两个对指标影响较大的因素，设计二因素三水平的星点设计-效应面法优化Bud 脂质体制备工艺。因素水平见表1，以综合评分Y为考察指标，按照星点设计-响应面法设计进行试验见表2、图2，方差分析结果见表3。

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

图2 Bud 脂质体制备工艺优化的效应面图Fig 2 Response surface for optimization of preparation process of budesonide liposomes

表1 星点设计-效应面法的因素水平表Tab 1 Factor and level of central composite design-response surface method

采用Design-Expert 10.0.7 软件对表2数据进行拟合，得到综合评分Y的回归方程为Y＝0.8897 - 0.0854A+ 0.0527B- 5.9275AB-0.0874A2-0.0902B2，模型P＜0.01，与数据的拟合度好，误差低，可用于进一步分析与检测。通过Design-Expert 10.0.7 软件对优选的制备工艺条件进行预测，A＝4.5∶1，B＝4.0∶1，Y的预测值为0.92。应用Design-Expert 10.0.7 软件对优选的制备工艺条件进行预测，A＝4.5∶1，B＝4.0∶1，Y的预测值为0.92。结合实际操作条件，初步确定优选工艺参数为：脂药比4.5∶1，V有机/V水相＝4.0∶1，按照优选参数，采用逆向蒸发法制备3 批Bud 脂质体。结果表明，3 批样本的包封率为（82.15±0.34）%、载药量为（12.71±0.34）%、粒径为（273.8±3.4）nm、Y为（0.95±0.01），说明工艺稳定可行，重现性好。

表2 星点设计-效应面法的结果Tab 2 Central composite design-response surface method

2.3 Bud 脂质体温敏凝胶的制备

采用冷溶法制备Bud 脂质体温敏凝胶。精密称取泊洛沙姆407（P407）、泊洛沙姆188（P188）和羟丙基甲基纤维素（HPMC）适量，在磁力搅拌下缓慢加入到一定量的脂质体中，搅拌均匀后，于4 ℃下静置溶胀24 h，即得。

2.4 Bud 脂质体温敏凝胶工艺优选指标

2.4.1 胶凝温度 采用试管倒置法[13]测定胶凝温度。试管中加2 mL 凝胶溶液，插入温度计，置恒温水浴锅中，从25 ℃开始缓慢升温，每隔0.2 ℃将试管倾斜180°以观察溶液的流动情况。溶液不流动时的最低温度即为胶凝温度，重复3次取平均值。

2.4.2 累积释放度的测定 采用Franz 扩散池对药物的累积释放度进行测定[14]。供给池和接收池间以半透膜隔离。向接收池中加入恒温至37.5℃的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）释放介质，将Franz 扩散池置于37.5℃恒温水浴磁力搅拌器中。取Bud 脂质体温敏凝胶1.0 mL，加入到供给池中，放置10 min，待凝胶胶凝后开始搅拌。分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12 h 各取样0.4 mL，同时补充恒温介质0.4 mL。按“2.1.1”项下方法测定Bud含量。

2.4.3 评价指标——综合评分法 以胶凝温度（Y1）和累积释放度（Y2）的综合评分（Y）为评价指标[15]，其中：

Y1＝胶凝温度/32 ℃，Y1评分实行分段评分，即：当Y1≥1时，Y1评分＝1/Y1×80；当Y1＜1 时，Y1评分＝Y1×80；

Y2＝∣Q2h-20%∣+∣Q6h-50%∣+∣Q12h-80%∣，Y2评分＝Y2min/Y2×20；

Y＝Y1评分+Y2评分。Y值越大指标越好。其中，Q2h、Q6h、Q8h分别为2 h、6 h、8 h 后的累积释放度；Y2min为Y2最小值。

2.5 单因素对处方用量的考察

2.5.1 P407 用量的考察 固定处方中其他用量，分别加入14%、16%、18%、20%、22%、24%的P407 制备Bud 脂质体温敏凝胶，测定胶凝温度分别为38.8、36.2、33.5、31.0、30.0、29.0℃。表明随着P407 用量的增加，胶凝温度逐渐降低，当P407 的用量小于16%时，温敏凝胶在37℃仍未发生胶凝。

2.5.2 P188 用量的考察 固定处方中其他用量，分别加入1%、2%、3%、4%、5%、6%的P188制备Bud 脂质体温敏凝胶，测定胶凝温度分别为28.9、30.8、33.5、35.5、37.2、39.0℃。表明随着P188 用量的增加，胶凝温度逐渐增大，当P188 的用量大于5%时，温敏凝胶在37.5℃仍未发生胶凝。

2.5.3 HPMC 用量的考察 固定处方中其他用量，分别加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的HPMC 制备Bud 脂质体温敏凝胶，测定胶凝温度分别为34.3、34.0、33.8、33.6、33.5℃。表明随着HPMC 用量的增加，胶凝温度逐渐减小，但减小的趋势不显著。

2.6 正交试验优选温敏凝胶的处方组成

根据单因素试验，确定各因素的水平，以“2.4.3”项下Y为综合评价指标，进行L16（45）正交试验，因素水平见表4，正交试验结果见表5，方差分析见表6。

表4 正交试验设计的因素水平(%)Tab 4 Factor and level of orthogonal test (%)

由表5及表6中可知，处方中各因素对Bud脂质体温敏凝胶质量的影响程度依次为AB ＞A ＞C ＞B，优选水平组合为A3B3C1，即优选处方为P407 用量20%、P188 用量4%、HPMC 用量0.4%。

表5 正交试验设计与结果Tab 5 Orthogonal test

表6 方差分析Tab 6 Variance analysis

2.7 最佳工艺的验证

按优化的最佳工艺条件平行制备3 批样品，平均胶凝温度为（33.1±0.1）℃；平均体外累积释放度Q2h（13.6±0.2）%、Q6h（41.6±0.4）%、Q12h（72.6±1.1）%；平均综合评分（90.12±0.43）；分别用超纯水将3 批样本稀释10 倍，置于NDJ-5S数字式粘度计样品池中，通过Zetasizer Nano ZS纳米激光粒径测定仪对其粒径和Zeta 电位进行测定，每个样平行测3 次。分别用超纯水将3 批样本稀释10 倍，置于NDJ-5S 数字式粘度计样品池中，通过Zetasizer Nano ZS 纳米激光粒径测定仪对其粒径和Zeta 电位进行测定，每个样平行测3次。平均粒径为（285.2±6.7）nm，平均Zeta 电位为-（45.8±5.3）mV，分布见图3。制备的脂质体的平均粒经和平均Zeta 电位分别为（273.8±3.4）nm 和-（31.9±2.16）mV，可知制成脂质体温敏凝胶后粒径和Zeta 电位绝对值有增大的趋势，但影响不明显。经验证该Bud 脂质体温敏凝胶在体温条件下能迅速胶凝，且累积释药性能良好。

图3 Bud 脂质体温敏凝胶的粒径（A）和 Zeta 电位分布（B）Fig 3 Particle size（A）and Zeta potential distribution（B）of Bud liposome temperature sensitive gel

2.8 稳定性初步考察

按最佳处方工艺制备Bud 脂质体温敏凝胶，置密闭西林瓶中，于4℃冰箱避光保存，分别于第0、15、30、45、60日取样，观察外观性状，测定胶凝温度及药物含量。结果表明在考察的时间范围内，Bud 脂质体温敏凝胶外观、胶凝温度、含量、粒径和Zeta 电位无明显变化，可满足后续药效学和药动学的研究要求。

3 讨论

Bud 为亲脂性药物，几乎不溶于水，难以有效分散于水溶性凝胶中，故将其包裹于脂质体，以有效分散于温敏凝胶中，从而发挥缓释、局部靶向作用[16]。Bud 脂质体温敏凝胶，在常温下为自由流动的液体，在灌肠后可快速均匀分布于降结肠、乙状结肠、直肠，后在体温调节下迅速胶凝，黏度升高以对抗肠道自蠕动。另外，脂质体还可提高局部黏膜的滞留量，减少全身作用[8]。包封率、载药量、粒径、分散指数、电位等均为评价脂质体制备工艺的指标，一方面指标过多容易导致试验难度增加；另一方面，预试验中各考察因素对分散指数和电位并无显著影响，故选择包封率、载药量和粒径为指标，采用加权后综合评分进行全面评价，不仅能全面反映各检测指标对脂质体的重要程度，也能直观反映整体制备工艺[11]。

胶凝温度是温敏凝胶的一个重要指标，温敏凝胶灌肠后，若在病灶部位短时间内不能相变，会因肠道自蠕动作用而漏出，且凝胶所载药物会发生突释，降低制剂的缓释作用，因此选择胶凝温度在30 ～34℃为宜[16]。为保证该直肠给药系统在室温下为液态，便于给药和分布，进入直肠后迅速的胶凝，本研究以32℃为胶凝温度的参考温度[17]。然而，制剂质量的好坏不只取决于胶凝温度，还与合适温度下药物能否充分释放有关。故本研究在单因素筛选出各基质的合理范围后，继以胶凝温度和累积释放度的综合评分为指标，使优选出的Bud 脂质体温敏凝胶在生理温度下迅速胶凝，发挥良好的释药作用。

在筛选处方时，P407 的质量分数影响最为显著，这与P407 在处方中的作用与贡献是一致的。泊洛沙姆分子是排列整齐的Z 字形结构。当温度升高时，Z 字形结构可能转变为缠绕紧密的折叠结构，而且缠绕越来越紧密，形成更黏稠的凝胶[18]。P407 是由聚氧乙烯（PEO）、聚氧丙烯（PPO）组成的PEO-PPO-PEO 非离子型三嵌段共聚物，其中PEO 与PPO 的质量比为7∶3。加入P188 后，相对增加了PEO 的比例而降低了PPO的比例，升高了体系的胶凝温度。但P188 的用量过大时，本身已胶束化的P188 分子亦可参与凝胶构成，又导致体系胶凝温度降低。因此要调节P407 的胶凝温度需选择P188 合适的用量[19]。本研究还发现P407 与P188 存在较为显著的交互作用，其对指标的影响甚至大于P407 与P188 各自的影响。

虽然本研究对该直肠定向给药制剂进行了初步研究，但对于其生物有效性、安全性尚待进一步研究，以期为UC 患者提供可靠的药物制剂。