黄芩苷通过Bcl-2/Caspase-3信号通路促HepG2细胞凋亡

郎超

（山西药科职业学院，山西太原 030031）

黄芩，又名山茶根，是唇形科黄芩属多年生草本植物，主要分布于我国东北地区和内蒙古自治区中东部，味苦而寒，清热、抗病毒、消炎和抗氧化等作用显著[1-3]。黄芩药材中含有黄芩苷、黄芩素等多种有效提取物成分。近年来的报道称，黄芩苷除了具有传统抗炎、抗氧化、抗病毒等功效外，还具有较为广泛的抗癌活性[4-6]。本研究选用黄芩苷处理人肝癌细胞HepG2，通过MTT实验检测黄芩苷对肿瘤细胞存活的影响，并使用细胞流式检测、Western Blot实验和实时定量PCR实验，对黄芩苷诱导肿瘤细胞凋亡的促进效应做了初步的探讨。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

黄芩苷（baicalin），95%，溶于DMSO，上海源叶生物科技有限公司；Caspase3、Bcl-2、Bax等抗体试剂，上海碧云天生物技术有限公司；Trizol-RNA提取试剂、q-RTPCR实验相关试剂盒，日本TAKARA公司；DMEM培养基，生工生物工程（上海）股份有限公司；penicillin-streptomycin，日本同仁公司；细胞凋亡检测试剂盒，前尘生物科技有限公司；引物由Invitrogen（上海）合成。

Galaxy 170 S二氧化碳培养箱，德国Eppendorf公司；MX2型微孔板振荡器，韩国FINEPCR公司；Infinite F50型酶标仪，瑞士Tecan公司；TG-16型离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；BD FACSCalliburⅡ型流式细胞仪，美国BD公司；PowerPac HC型电泳仪、CFX Connect型荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养

MCF-7（人类乳腺癌上皮细胞株）于DMEM培养基中培养，加入10% FBS及1% penicillin-streptomycin，培养条件：5% CO2、37 ℃、55%湿度。

1.3 MTT实验

选取适量处于对数生长期的HepG2细胞，接种在96孔板中，细胞充分贴壁后，分别加入200 μL含20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L黄芩苷的培养基，每组5个复孔，对照为PBS，在5% CO2、37 ℃、55%湿度条件下培养24 h后取出；更换100 μL新鲜培养基，再加入20 μL MTT（5.0 mg/mL），继续培养约4 h后终止细胞培养。在避光环境下，将孔内培养液吸净后加入150 μL的DMSO，低速震荡10 min。置于酶标仪，检测570 nm处各孔的吸光度值。按照式（1）计算黄芩苷对HepG2细胞生长的抑制率。

其中，A1为实验组吸光度均值，A0为对照组吸光度均值。

1.4 细胞凋亡检测

将经不同浓度黄芩苷（0、50 μmol/L、100 μmol/L）处理24 h的HepG2细胞收集起来后，1 000 r/min离心10 min，弃去上清，加入1×结合缓冲液100 μL重悬细胞沉淀，并转移至流式细胞管中，加Annexin V-FITC 5 μL和 PI 5 μL，避光染色 15 min；加入1×结合缓冲液400 μL，流式细胞仪检测，Annexin V-FITC荧光通道为FL1-H，PI荧光通道为FL2-H，获取细胞数量为15 000个/样，不足15 000个收取全部细胞；最后于流式细胞仪上机检测，结果用FlowJo软件分析，统计细胞凋亡百分率。

1.5 Western Blot实验

将黄芩苷处理过的HepG2细胞收集起来，经裂解提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取样20 μL电泳分离、转膜、5%脱脂奶粉封闭2 h。接对应蛋白一抗孵育过夜（4 ℃、摇床缓慢摇动）。次日，接经辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗孵育2 h（室温、摇床缓慢摇动）。TBST溶液充分洗净杂交膜后，在暗室内滴加发光液，经X-光胶片曝光、显影、定影处理后，条带记录对应蛋白的表达情况。用Image Lab软件进行定量分析。

1.6 实时荧光定量PCR

收集加黄芩苷后培养24 h的HepG2细胞，提取总RNA，逆转录为cDNA，稀释。5 ng cDNA、引物各0.4 μmol/L（序列见表 1）和 7.5 μL Mix组成的 15 μL反应体系上机进行实验。内参基因为GAPDH。ΔΔCt法分析其表达情况。

表1 相关引物序列

2 结果与分析

2.1 黄芩苷抑制HepG2细胞的增殖

通过MTT实验检测了黄芩苷对HepG2是否存在增殖抑制效应，如图1所示，黄芩苷浓度与HepG2细胞增殖抑制率正相关。

图1 黄芩苷抑制HepG2细胞增殖（剂量依赖）

2.2 黄芩苷诱导HepG2细胞发生凋亡

用流式细胞仪检测经黄芩苷处理后的HepG2细胞凋亡情况，如图2所示。对照组HepG2细胞的凋亡率为3.71%，早、晚期凋亡率分别为3.08%和0.63%；经50 μmol/L与100 μmol/L黄芩苷处理后，HepG2细胞凋亡率分别为22.20%（19.70%+2.50%）、54.87%（48.80%+6.07%）。结果表明，黄芩苷可有效促进HepG2细胞凋亡，并呈现剂量依赖效应。

图2 黄芩苷诱导HepG2细胞凋亡

2.3 黄芩苷诱导HepG2细胞内凋亡相关蛋白高表达

经 30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L 黄 芩 苷处理24 h后，HepG2细胞内Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达情况如图3所示，相对表达量如图4所示。从图中可以看出，与对照组相比，实验组HepG2细胞中Caspase-3的表达明显上调（P＜0.05），Bcl-2相对表达量显著下调（P＜0.05），Bax的表达明显上调（P＜0.05)，且呈浓度依赖关系。

图3 黄芩苷处理后HepG2细胞内凋亡相关蛋白表达Western Blot结果

图4 黄芩苷处理后HepG2细胞内凋亡相关蛋白相对表达量

2.4 黄芩苷诱导HepG2细胞内凋亡相关分子mRNA高表达

实时定量荧光PCR法检测不同浓度黄芩苷处理后HepG2细胞中Caspase-3、Bcl-2及Bax的表达量，如图5所示。可以看出，Caspase-3的表达明显上调（P＜0.05），Bcl-2相对表达量显著下调（P＜0.05），Bax的表达明显上调（P＜0.05），且呈浓度依赖关系。

图5 黄芩苷处理后HepG2细胞内凋亡相关因子的mRNA相对表达量

以上结果表明黄芩苷可诱导HepG2细胞发生凋亡，且与Bcl-2/Caspase-3信号通路相关。Bcl-2家族和Caspase家族是细胞凋亡的标志性分子，Caspase-3是Caspase家族中多条凋亡通路的共同下游；Bcl-2和Bax可作为上游分子，通过线粒体途径激活死亡蛋白执行酶Caspase-3，参与细胞凋亡的执行。其中，Bax基因参与促凋亡，而Bcl-2参与抑制凋亡[7-8]。

近年来，越来越多的报道开始聚焦于黄芩苷抗肿瘤的机制研究，如何更为高效地发挥中药小分子类药物的抗肿瘤效应成为热点课题。通过本研究前期实验及相关研究表明，黄芩苷的抗肿瘤机制主要有抑制增殖、调控周期、诱导自噬、促进凋亡等[9-11]。细胞凋亡作为一种细胞起始死亡过程，在肿瘤发展与治疗中具有重要作用[12]。

3 结论

本实验初步研究了黄芩苷对肝癌肿瘤细胞HepG2的凋亡诱导效应，结果表明其诱导凋亡与Bcl-2/Caspase-3信号通路相关。Caspase家族相关的细胞凋亡的途径广泛，其上下游效应分子及相关调控机制也很复杂，本研究仅探讨了其中可能的一种通路，还需要进一步探寻黄芩苷发挥作用的关键靶点，为其抗肿瘤机制的研究提供新的参考。