高乳糖饮食叠加水平台法脾虚证模型研究与评价

卢梦雄 黄金科 王一帆 薛 红 王凤云 唐旭东,

(1 北京大学中医药临床医学院(西苑)，北京，100091； 2 中国中医科学院西苑医院，北京，100091)

脾是中医脏象理论的重要组成部分，脾的生理功能主要体现在主运化谷食水饮，主统血，在体合肉，主四肢[1]。为验证模型成功与否，现代研究者依据脾的功能和特性，用相应的生物化学等指标类比。脾主运化的功能以尿D-木糖排泄率或血清D-木糖吸收率作为辅助实验室参考指标[2]，脾主统血则类比到凝血功能的异常，如血小板数量下降[3]，在体合肉，主四肢则被阐释为骨骼肌生理功能的异常，表现在抓力、腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)水平、糖原水平下降等方面[4-6]，也有报道胃蛋白酶原和胃促生长素水平的降低[7-8]。但目前对特定模型的评价指标多较单一，不全面，且对造模过程中指标动态变化掌握颇少。

目前脾虚证造模方法多类比脾虚证的致病因素。脾虚证的致病因素有：饮食失节，损伤脾胃；过于劳神，损伤脾气；素禀不足或年老体衰；过服苦寒泻下药物，损伤脾阳；他脏病变影响脾运等。相应的造模方法则有苦寒泻下法、耗气破气法、饮食失节法、饮食偏嗜法、劳倦过度法等。有些造模方法采用单一因素或患者不常接触因素，如大黄、番泻叶等，不能真实反映现代人群脾虚证的成因。

东亚人群成年后乳糖酶活性缺乏，乳糖不能被消化、吸收，出现腹痛、腹胀、腹泻、肠鸣等症状，称为乳糖不耐受[9-11]，此症状与脾虚证类似，而随着近些年乳制品消费增加，乳糖不耐受在我国发病逐渐增加[11-13]，用高乳糖饮食造模切合实际。现今人群普遍工作时间长，饮食不规律，在饥饿与过饱间频繁转换，因此劳倦过度和饮食失节是脾虚证重要的致病因素。本模型基于课题组前期工作[14-15]，用高乳糖饲料饲喂既是饮食偏嗜，又是泻下之法，用水平台站立法模拟劳倦过度，用不定时投喂来模拟饮食失节，是所谓复合因素法，能够更好模拟现代脾虚证人群真实情况。为避免普通饲料中不可控因素对实验结果的影响，使用美国营养学会(American Institute of Nutrition，AIN)制定的AIN-93G纯化饲料作为基本饲料[16]，以满足大鼠生长发育所需营养，并在保证各大营养素总量不变的基础上设计高乳糖饲料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)级雄性SD大鼠42只，7周龄，体质量(260±20)g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司。动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。实验动物使用许可证：SYXK(京)2018-0018。常规饲料适应性喂养1周，每日日光灯照射(08：00-20：00)，室内温度(22±2)℃。本研究涉及动物实验经中国中医科学院西苑医院动物伦理委员会批准(伦理审批号：2019XLC004)。

1.1.2 试剂与仪器 40%高乳糖饲料和标准AIN-93G标准饲料，购自北京科澳协力饲料有限公司。配方见表1。D-木糖(北京酷来搏科技有限公司，货号：CX12001-100G)，D-木糖试剂盒(Cohesionbio公司，英国，货号：CAK1238)，大鼠胃蛋白酶原酶联免疫吸附试验试剂盒(艾恩斯生物科技有公司，货号：34607)，大鼠饥饿素酶联免疫吸附试验试剂盒(艾恩斯生物科技有公司，货号：30838)，三酰甘油(Triacylglycerol，TG)生化试剂盒(艾恩斯生物科技有公司，货号：30371S)，腺苷三磷酸生化试剂盒(艾恩斯生物科技有公司，货号：30726S)，肌糖原生化试剂盒(艾恩斯生物科技有公司，货号：34667S)。水环境小平台站立箱(112 cm×62 cm×41 cm)箱体，设置15个小平台，平台直径8 cm，高10 cm，平台周边注水，水深2 cm，水温保持(20±2)℃(自制)。高速冷冻离心机(Siemens公司，德国，型号：Z326K)，酶标仪(Biotek公司，美国，型号：Synergy LX)，大小鼠抓力测定仪(上海移数信息科技有限公司，型号：YLS-13A)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 采用随机数字表法将42只SD大鼠分为7组，其中正常组12只，模型大鼠分为造模2周组、造模3周组、造模4周组，每组6只，造模2周停造1周组、造模3周停造1周组、造模4周停造1周组，每组4只。正常组给予标准配方饮食。模型SD大鼠给予40%高乳糖饲料，并且每日17：00至次日8：00放入水平台中，不定时给予食物。分别于2周、3周、4周处死6只造模2周组、造模3周组、造模4周组大鼠和4只正常组大鼠，造模2周停造1周组、造模3周停造1周组、造模4周停造1周组停止造模1周，观察后处死。

1.2.2 检测指标与方法

1.2.2.1 体质量测定 每天观察动物毛发神态活力，每周称量动物体质量。

1.2.2.2 粪便含水量测定 每周1次收集大鼠湿便称重，放入37 ℃烘箱中烘烤24 h，干便称重，含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.2.2.3 抓力测定 每组大鼠每周进行1次抓力测定，连续测3次，取平均值。

1.2.2.4 血清D-木糖含量测定 取材时按1 mL/100 g剂量给大鼠灌胃3% D-木糖溶液，2 h后麻醉，腹主动脉取血，3 000 r/min，离心半径18 cm，离心15 min取血清，用分光光度法测定。

1.2.2.5 血清胃蛋白酶原酶、胃促生长素、三酰甘油测定 分别用酶联免疫吸附试验法和分光光度法测定。

1.2.2.6 肌肉ATP、糖原测定 取大鼠左后腿腓肠肌液氮冷冻备用，分光光度法测定ATP、糖原含量。

1.2.2.7 小肠病理学 取大鼠幽门下15 cm肠段，用0.9%氯化钠溶液洗净放入多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，苏木精-伊红(HE)染色。观察小肠绒毛和腺体病理形态。

1.2.2.8 脾虚证判定 依据中华中医药学会脾胃病分会发布的《脾虚证中医诊疗专家共识意见(2017)》中脾虚证诊断标准[17]，高乳糖饲喂复合因素法大鼠模型脾虚证判定：溏稀便或水样便，肠道胀气，体质量增加缓慢或减轻，纳呆、少动、皮毛干枯少光、抓力下降等。

2 结果

2.1 一般体征 正常组大鼠皮毛光亮，肛门干净，精神良好，活动度正常，粪便颗粒分明，体质量增长正常。大鼠给予高乳糖饲料1～2 d后出现明显黄色水样稀便，并且随着造模时间的延长，皮毛逐渐变黄凌乱，失去光泽，肛周出现污秽，倦卧眯眼，活动度差，体质量增长缓慢甚至下降。但从第3周开始出现水样便症状的缓解，个别出现成形便，体质量也出现增长趋势。

2.2 各组体质量比较 从造模开始，造模2周组、造模3周组、造模4周组和正常组的平均体质量差距逐渐变大，造模3周组差距达到最大，体质量增长最缓慢。见图1。

图1 各组大鼠体质量比较

2.3 各组抓力比较 从造模开始，造模2周组、造模3周组、造模4周组和正常组抓力差距渐大，造模3周组达到最大。见图2。

图2 各组大鼠抓力比较

2.4 各组粪便含水量比较 从造模开始，造模2周组、造模3周组、造模4周组和正常组的粪便含水量差距逐渐变大，造模2周组差距达到最大，而后回落，到造模4周组差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 各组粪便含水量比较

2.5 各组血清D-木糖水平比较 血清D-木糖水平，造模2周组较正常组明显降低(P<0.001)，造模2周停造1周组则差异无统计学意义(P>0.05)；造模3周组和造模3周停造1周组较正常组升高(P<0.01，P<0.05)，造模4周组和造模4周停造1周组较正常组差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4 各组血清D-木糖水平比较

2.6 各组血清胃蛋白酶原水平比较 各组较正常组血清胃蛋白酶原水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

图5 各组血清胃蛋白酶原水平比较

2.7 各组血清胃促生长素水平比较 造模3周停造1周组血清胃促生长素水平较正常组降低(P<0.05)，造模3周组和造模3周停造1周组、造模4周停造1周组较造模2周组显著降低(P<0.05)。见图6。

图6 各组血清胃促生长素水平比较

2.8 各组血清三酰甘油水平比较 造模2周停造1周组和造模3周组血清三酰甘油水平较正常组和造模2周组增加(P<0.05)，其余组差异无统计学意义(P>0.05)。见图7。

图7 各组血清三酰甘油水平比较

2.9 各组肌肉ATP水平比较 各组与正常组之间肌肉ATP水平差异无统计学意义(P>0.05)。但造模2周停造1周组、造模3周停造1周组较造模2周组显著降低(P<0.05)。见图8。

图8 各组肌肉ATP水平比较

2.10 各组肌肉糖原水平比较 造模2周停造1周组糖原含量较正常组和造模2周组减少(P<0.05)。见图9。

图9 各组肌肉糖原水平比较

2.11 各组血小板计数比较 造模3周组血小板计数较正常组明显减少(P<0.001)，其余组差异无统计学意义(P>0.05)。见图10。

图10 各组血小板计数比较

2.12 各组红细胞计数比较 造模2周组、造模3周组、造模4周组红细胞计数较正常组明显增加，各停造1周组差异无统计学意义(P>0.05)。见图11。

图11 各组红细胞计数比较

2.13 各组小肠病理 正常组小肠绒毛排列整齐，结构完整，密度适中，底部腺体发达。与正常组比较，造模2周组小肠绒毛凌乱，结构破损，但依稀能看出绒毛形态。造模3周组小肠绒毛结构完全破坏，堆叠。造模4周组小肠绒毛形态较清晰，但密度稀松。见图12。

图12 各组小肠病理比较(HE染色，×100)

3 讨论

脾虚证模型从1979年北京师范大学生物系消化生理科研组用大黄水煎剂灌胃昆明种小白鼠以来[18]，产生出众多的造模方法，最终都落脚在动物表现出脾主运化、脾主升举、脾主统血等功能的降低，对应现代医学中的消化吸收功能不足、能量代谢低下、机体状态衰退等临床综合征[19]。学界较为公认的评价指标是D-木糖水平测试，但此指标并不能完全覆盖所有模型，因此有必要对动物模型进行系统评价。课题组已建立高乳糖叠加水平台法所致脾虚证模型[20]，本研究则在此基础上增加饥饱失常造模因素，使之更符合真实世界的情况，并且已有模型评价指标局限于血清D-木糖水平，只能代表脾主运化的功能，本研究则对脾的主要功能的代表性指标都进行了检测，广泛评价本模型的适用性。脾虚是个动态的过程，不同功能明显减弱的时间节点不同，本研究也进行了时间上的探索。

从一般体征来看，造模3周组脾虚证最明显，造模4周组精神和活动度等逐渐好转。从体质量来说，造模3周组较正常组下降最多，造模4周组与正常组差异逐渐缩小。在抓力和粪便含水量方面，也是造模3周组最为明显，造模4周组则有回升之势。

根据分子生物学和病理学来看，则出现结论的分化。从血清D-木糖水平来看，造模2周组降低最为明显，提示吸收功能的下降，造模3周组反而升高。从血清TG水平来看，造模3周组增加最为明显，提示脾虚运化脂质的能力不足，导致其在血液中累积[21]。在血小板计数上，造模3周组明显降低，提示3周为脾主统血功能下降的最优时间节点。在红细胞计数上，各造模组均较正常组高，可能是由于腹泻一直处于体液失衡状态，也可能是因为能量供应不足而代偿性升高以增加供氧。小肠病理显示，造模2周组到造模3周组结构破坏逐渐严重，而造模4周组有所恢复，提示大鼠对单一浓度乳糖的耐受过程。其余指标差异不明显可能是由于本研究样本量较小，也可能与相关文献中造模方法与本研究不同有关。停止造模后1周，大鼠各类指标反弹，为后续用药干预研究提供了参考，即造模与给药必须同时进行。

本模型在不同指标上的表现不一致。在脾虚证的一般体征表现和“脾主统血”方面，造模3周组最为明显，而在代表“脾主运化”的D-木糖吸收率上则是造模2周组最为明显。这提示脾虚证的动态过程，即脾的不同功能的降低有先后，本模型的致病因素从影响“脾主运化”功能进而影响到其他功能。

综上所述，本研究用单一高浓度乳糖饮食叠加水平台站立与饮食失节法干预成功建立大鼠脾虚证模型，在2周时“脾主运化”功能降低明显，在3周时有最明显脾虚证体征和“脾主统血”功能降低，生化和病理的部分证据也支持此结论。