HPLC法测定参苓安神胶囊中橙皮苷含量

李 建 黄宇思 赖 慧 王 谦 米晓琴 赵福兰 陈 立

参苓安神胶囊是根据西南医科大学附属中医医院一名老中医多年临床用药经验，以参苓白术散与枣仁安神颗粒基础方加减变化而成，由酸枣仁、党参、茯苓、陈皮、白术、甘草等药物组成的复方制剂[1]，在临床应用多年，疗效确切，安全可靠。本方是治脾虚失眠的代表方。生理条件下,脏腑调和,气血充足,心有所养,心血得静,卫阳入于阴而寐[2]。“脾胃为后天之本”“气血生化之源”，脾胃虚弱，纳运乏力，故饮食不化；水谷不化，清浊不分，症见肠鸣泄泻，湿滞中焦，气机被阻，而见胸脘痞闷；脾失健运，气血生化不足，则心神失养，出现心悸、失眠和健忘，此症为典型的子病(脾虚)及母(心悸、失眠)，治宜补益脾胃，使心脑有所濡养，而心悸、失眠之证自解[3]。在前期的研究中已将方中酸枣仁、党参、白术、陈皮进行了薄层定性鉴别[4]。为进一步控制制剂，应用HPLC对制剂中所含的有效成分橙皮苷进行了含量测定。

1 仪器与试药

SSI(美国科学系统公司)液相色谱，浙大N3000色谱工作站；JL-180DTH超声波清洗器；sartoriusBP211D型电子天平(感量0.1 mg；0.01 mg，载量210 g；80 g)，橙皮苷对照品(721-201211)购自中国药品生物制品检定所，参苓安神胶囊三批(202007012，202007025，202007034);所用甲醇为色谱纯，水为医院制剂室自制重蒸馏水，试验所用其他试剂均为分析纯，不再一一列出。参苓安神胶囊及陈皮的阴性对照样品由医院制剂室自制。

2 方法

2.1 指标性成分选择参苓安神胶囊由酸枣仁、党参、茯苓、陈皮、白术等组成，可选指标成分较多，结合现有文献资料研究[5]，酸枣仁为方中君药之一，但其主要成分酸枣仁皂苷A、B及斯皮诺素在国内复方制剂中测定含量的很少，且本方中酸枣仁的用量不大，测定其含量难度较大，故选性质比较稳定含量较高的橙皮苷为指标性成分进行含量控制。

2.2 检测波长的选择对橙皮苷对照品溶液进行紫外扫描(200～700 nm)，由紫外图谱可见橙皮苷在283 nm波长处峰最高，是最大吸收，故实验选择283 nm 作为本次实验橙皮苷含量测定的检测波长。

2.3 橙皮苷对照品溶液的制备精密称定橙皮苷对照品6.28 mg于50 ml容量瓶中，制成0.1256 mg/ml的溶液作为母液，稀释2倍即得。

2.4 供试品溶液的制备

2.4.1 提取溶剂的考察取参苓安神胶囊内容物共9份，每份1 g，精密称定，置平底烧瓶中,精密加甲醇、乙醇及水80 ml，每种溶剂各3份，加热回流30 min，取出放冷，滤过，滤液置100 ml容量瓶中，用少量相应溶媒分次洗涤，洗液滤入同一容量瓶中，再加相应溶媒至刻度，摇匀，取定容后的溶液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得供试品。按本实验色谱条件进行测定。见表1。

表1 提取溶剂的考察结果

由表1可见，3种提取溶剂中以甲醇作为溶媒，橙皮苷的含量最高，乙醇次之，水最低，故实验以甲醇作为提取溶剂。

2.4.2 提取方法的考察实验用超声处理和加热回流进行了对比试验。取参苓安神胶囊内容物共6份，每份1 g，精密称定，置平底烧瓶中,精密加甲醇80 ml，加热回流30 min和超声提取30 min，取出放冷以后，用滤纸滤过，滤液置洗净干燥好的100 ml容量瓶中，用少量甲醇分多次洗涤[6]，洗液滤并入同一容量瓶中，再加甲醇至刻度，摇匀，取定容后的溶液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。按本实验色谱条件进行测定，加热回流所得橙皮苷的含量明显高于超声处理结果，故本实验选用加热回流作为橙皮苷提取方法。见表2。

表2 提取方法的考察

2.4.3 提取时间的考察取参苓安神胶囊内容物共3份，每份1 g，按供试品制备方法分别提取15、30、45 min。按色谱条件测定，计算含量，加热回流30 min所得橙皮苷含量最高，所以本实验选择橙皮苷的提取时间为30 min。

综上所述，本实验供试品溶液制备方法如下：取参苓安神胶囊内容物1 g,精密称定，置平底烧瓶中,精密加甲醇80 ml，加热回流30 min，取出放冷以后，用滤纸滤过，滤液置洗净干燥好的100 ml容量瓶中，用少量甲醇分多次洗涤，洗液滤过后并入同一容量瓶中，再加甲醇至刻度，摇匀，取定容后的溶液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。见表3。

表3 提取时间考察结果

2.5 缺橙皮阴性溶液的制备按供试品制备方法同法制得。

2.6 色谱条件的选择流动相的选择实验曾参考陈皮药材的含量测定，选用①甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)；②甲醇：0.05 mol/l磷酸：水(32∶3∶65)；③甲醇-冰醋酸-水(30∶4∶66)[7]；④乙腈-0.15%的醋酸溶液(17∶83)为流动相进行橙皮苷的含量测定比较，流速按1.0 ml/min进行，柱温35 ℃，以AichromBond-AQ C18(250×4.6 mm，5 μm)柱为分析柱进行实验研究，结果①甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61为流动相，橙皮苷达到基线分离明显，峰形对称；阴性对照无干扰。故流动相选择甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)，流速1.0 ml/min，柱温35 ℃。

分析柱的选择 实验曾用AichromBond-AQ C18(250×4.6 mm，5 μm)、Kromtek C18(250×4.6 mm，5 μm)柱[8]，以甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)为流动相，2根柱子均能达到满意的分离效果，橙皮苷峰与相邻峰分离度都大于1.5，理论塔板数也大于2000。故方法学研究实验选用AichromBond-AQ C18(250×4.6 mm，5 μm)色谱柱。

2.7 标准曲线与线性范围精密称定橙皮苷对照品适量，加甲醇制成不同浓度的对照品溶液，摇匀，作为对照品溶液(0.0628 mg/ml)，分别精密进样1 μl、3 μl、5 μl、7 μl、9 μl、11 μl、13 μl、15 μl，按色谱条件进行分析，测定峰面积，橙皮苷进样量在0.0628～-0.942 μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系，得出回归方程及相关系数：Y=1E+06X+16645，R2=0.998(Y为峰面积，X为橙皮苷进样量，单位为μg)；最后以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积(A)为纵坐标(Y)绘制出标准曲线。

3 结果

3.1 精密度试验精密吸取对照品溶液(0.0628 mg/ml)及供试品溶液各10 μl，分别注入同一液相色谱仪，按实验所得出条件进行分析，分别测定5次，计算峰面积，对照品峰面积平均值为836741，RSD为0.65%；供试品峰面积平均值为535110，RSD为0.18%，实验结果表面该仪器精密度良好。

3.2 稳定性试验按前文对照品与供试品制备方法分别制得橙皮苷与对供试品溶液，放置于室温下，分别在不同的时间段进行含量测定，记录色谱图及结果，用以考察对照品与供试品溶液的稳定性，供试品及对照品溶液在配置后24 h内测定，结果稳定。见表4。

表4 稳定性实验结果

3.3 样品重现性试验称定参苓安神胶囊1 g，共5份，按样品制备方法和测定方法进行测定，参苓安神胶囊供试品含量平均值为2.38%，RSD=0.36%，表明该实验重现性良好，测定结果较为稳定。

3.4 加样回收率试验精密称取参苓安神胶囊适量，6份，分别加入对照品，按供试品测定方法进行测定，按加样回收率计算方法进行计算，测得平均回收率为99.4%，RSD=0.27%，表明回收率好。

3.5 样品测定按参苓安神胶囊含量测定方法对参苓安神胶囊3个批次的样品进行含量测定，HPLC图谱见图1。3个批次产品每粒含橙皮苷为1.20～1.30 mg，平均为1.26 mg，考虑到参苓安神胶囊含量结果与原药材批次有较大关系，影响药材含量的因素也较多，而且装量差异也对测定结果由影响，根据大生产实际要求，以平均含量下浮20%计算，暂定参苓安神胶囊每粒含橙皮苷含量不少于1 mg，待以后在研究中积累数据做进一步调整。见表5。

注：对照品(A)、供试品(B)阴性对照(C)。图1 橙皮苷对照品与供试品HPLC色谱图

表5 供试品中橙皮苷含量测定结果

4 讨论

方中的君药为党参、茯苓和白术，党参的主要有效成分多糖、苷类和甾醇类，用水煎煮提取，符合传统用药习惯，提取效果较好，在前期的研究中已经对党参进行了定性鉴别，故未对党参进行含量测定[9]；茯苓的主要成分为茯苓聚糖、茯苓酸、脂肪酸及无机物等，根据文献资料的查询，暂未找到可行的方法对茯苓有效成分进行测定；而方中白术进行了挥发油的提取，也对白术进行了定性鉴别，所以未对白术的定量鉴别进行进一步的研究。

试验中曾考虑将酸枣仁皂苷A、B作为质量控制指标，但由于文献资料太少，且酸枣仁用量较少，没有取得很好的效果，并且酸枣仁在前期的研究中已经做了定性研究，而本方是医院院内制剂，考虑生产成本及实际生产需要，对方中的其他药材没有做进一步含量测定，待以后进一步研究中逐步完善质量标准。

实验中甲醇提取和乙醇提取含量差异不大，也曾尝试将乙醇作为提取溶剂，但乙醇提取成分较多，干扰峰较多，分离度也不好，也不易于挥干，挥干后也难于再次溶解定容， 2.4用HPLC测定参苓安神胶囊中橙皮苷的含量，可查文献资料多，技术成熟，具有操作简单、重现性好、测定数据可靠等优点,此方法可行性较高,可作为该制剂的质量控制。