基于柴胡“推陈致新”与网络药理学探讨柴胡干预肝纤维化的分子机制

肝纤维化是慢性肝病常见的病理特征和向肝硬化进展的必经途径，是指肝组织内细胞外基质成分过度增生与异常沉积，导致肝脏结构和功能异常的病理变化。若病情持续进展，可引发肝衰竭、肝性脑病等严重的并发症

。目前尚无治疗肝纤维化的特效药物，病因治疗仍是防治肝纤维化的主要方案。柴胡是治疗肝病的常用中药，对于柴胡的功效，除了众所周知的疏肝解郁、升阳举陷、退热等，《神农本草经》还记载其能“推陈致新”，但后世详论者甚少，这一作用具体所指尚未有定论。现代研究表明，柴胡能改善肝纤维化和肝功能，但其作用机制及发挥药效的活性成分尚不清楚。本文立足于分析柴胡“推陈致新”的中医内涵，并运用网络药理学方法，探讨柴胡的药效活性成分干预肝纤维化的可能机制。

1 柴胡“推陈致新”作用蕴含再生理念

中药提到“推陈致新”功效首见于《神农本草经》，书中记载仅柴胡、大黄和硝石具有“推陈致新”的功效

。大黄和硝石的“推陈致新”主要指攻下推陈之用。但对于柴胡，《神农本草经》记载：“气味苦平无毒，主心腹肠胃中结气，饮食积聚，寒热邪气，推陈致新。久服轻身、明目、益精。”虽明确其“推陈致新”，且后世详论者少，尚未有统一的认识。中医认为，人体之“陈”包括燥热、气滞、湿热、瘀血、痰浊等外来或内生邪气。“推陈”即消除各种致病因素或病理产物，“致新”即促进新旧更替、精微物质的生成，推陈致新即促进人体新陈代谢过程。柴胡主入肝胆经，能宣畅气血、行郁散结、和解表里，如清·张山雷《本草正义》谓柴胡：“振动清阳之气，则气血调和，陈莝去而自能生新”。《名医别录》亦指出柴胡：“除伤寒心下烦热，诸痰热结实，胸中邪逆，五脏间游气，大肠停积，水胀，及湿痹拘挛。”可见柴胡“推陈”的对象广泛，包括气滞、痰饮、水湿、瘀血、热结等，与其善调气机密切相关。柴胡禀少阳春生之气，还有生发少阳、助生气血之用，如清·叶天士《本草经解·卷二·草部下·柴胡》谓：“春气一至，万物俱新，柴胡得天地春升之性，入少阳以生气血也，故主推陈致新。”少阳为全身气机升降之枢纽，其应象胆腑和三焦，少阳气机调达，则清气上升，浊阴下降。《医学衷中参西录·柴胡解》记载柴胡能通利二便，促进胃肠更新。可见，柴胡通过“推陈”可宣畅气血、行郁散结、和解表里、通利二便等以消瘀滞，又能“致新”而发挥生发少阳、疏利肝胆，助脾胃运化等以促进气血化生，达到促进人体新陈代谢的作用。现代研究还发现，柴胡的有效成分能促进肝部分切除术后的小鼠肝再生，并可增加小鼠胆汁分泌量，因此认为，柴胡“推陈致新”蕴含再生理念

。

2 柴胡干预肝纤维化的网络药理学分析

2.1 资料与方法

2.1.1 筛选柴胡的活性成分及其作用靶点 基于中药系统药理学分析平台(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索柴胡的化学成分，设置阈值口服利用度(OB≥30%)和类药性(DL≥0.18)为限定条件

，筛选其活性成分及其作用靶点，并用Perl语言校正靶点的官方名称并筛除非人类靶点蛋白。

本文以厦门旅游业的发展为例，提出旅游业应实施可持续发展的生态策略。经过本文对课题内容的详细研究，结果表明合理发掘自身旅游资源，构建出城市独有的旅游特色，坚持人与自然和谐共生，才是旅游业能够持续发展的根本性策略。当然，当前厦门旅游业发展中也还存在一定问题并亟待整改提高。因此，在未来的研究过程中还应对课题内容进行深入细致的研究。

2.2 结果

2.1.3 构建“化合物-靶点-疾病”网络 使用Bioinformatics工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制韦恩图，筛选柴胡与肝纤维化的共同靶点，即柴胡干预肝纤维化的作用靶点。运用Cytoscape 3.7.2软件(https://cytoscape.org/)构建“化合物-靶点-疾病”网络。

根据美国CDC及GenBank中MV基因序列号（NM_KC164757.1），采用 Primer Premier 5.0 引物设计软件设计用于扩增MV N基因C末端的594个核苷酸（bp）片段的引物，该引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物（MV-60）为5′-GCTATGCCATGGGAGTAGGAGTGG-3′；下游引物（MV-63）为 5′-CCTCGGCCTCTCGCACCTAGT-3′[5]。

2.1.5 分子对接验证 通过分子对接进行活性成分与靶点蛋白结合活性的验证。从Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载活性成分的结构文件，PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载度值前10核心靶点的蛋白3D结构文件，用PyMol软件对受体和配体分子进行去水、加氢处理，Autodock vina软件进行分子对接，计算活性成分与靶点蛋白的最低结合效能，在PyMol软件中对结果进行可视化。一般认为，最低结合能绝对值大于4.25 kcal·mol

时有一定的结合活性，大于5.0 kcal·mol

表明有较好的结合活性，大于7.0 kcal·mol

说明具有强烈的结合活性

。

2.1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 基于R语言软件clusterprofile version 3.12.0对交集靶点进行GO富集分析和KEGG通路注释分析，设定阈值p value<0.05，认为在该条件下具有统计学意义，用R软件对前20的结果进行可视化，并对显著性前20的通路构建化合物-靶点-通路网络。

2.2.3 分子对接结果 表4为从PDB数据库获取的度值前10的核心靶点蛋白信息。通过Autodock vina软件计算获得的主要活性成分与靶点蛋白的最低结合能如图4所示，分子对接模式示例如图5所示。大部分最低结合能绝对值大于7 kcal·mol

，说明核心靶点和活性成分有较好的结合活性，且能通过氢键、π-π堆积作用等分子间作用力形成较为稳定的构象。

2.1.2 收集肝纤维化靶点 在OMIM数据库(http://www.omim.org/)及Genecards数据库(http://www.genecards.org/)检索关键词“Liver fibrosis”“ Hepatic fibrosis”获得肝纤维化的相关靶点，将2个数据库的结果合并，删除重复靶点，得到肝纤维化的相关靶点。

2.1.4 构建靶点蛋白互作网络 将交集靶点上传至String数据库(https://string-db.org/)，设置物种为“Homo sapiens”，获得高置信度的PPI网络，在Cytoscape 3.7.2软件中对网络进行可视化。用“Network Analyzer”工具进行拓扑学分析，将点度中心性≥2 倍中位数、中介中心性和接近中心性≥1倍中位数的靶点设为本研究的核心靶点

，并筛选度值前10的核心靶点

。

2.2.1 柴胡活性成分、作用靶点及肝纤维化的靶点 在TCMSP数据库获得柴胡符合条件的活性成分17种，去除无靶点预测的化合物后，共获得12种活性成分，163个对应的靶点。从OMIM数据库、Genecards数据库共获得肝纤维化相关靶点6 807个(图1)。

肝纤维化是病毒性肝炎、胆道梗阻和酒精性肝病等多种慢性肝病的核心病理改变，归属于中医学“积聚”“胁痛”等范畴，其病因病机在于邪毒久稽，导致肝脏形质损伤，阴精亏虚，气血不行，凝血蕴里而“虚损生积”

。柴胡是治疗肝病的常用中药，现代药理研究表明，柴胡提取物具有良好的抗肝纤维化活性，并能抗炎、抗氧化、促进肝细胞再生

。

目前治疗舟骨坏死的融合术式主要有三关节融合术、单纯距舟关节融合术、距舟－舟楔关节融合术，其他少用手术方法包括中足和内侧纵弓的重新排列等。有研究表明三关节融合术和距舟－舟楔关节融合术在治疗单纯性舟骨坏死上没有差异，都可缓解足背疼痛，但是三关节融合术主要应用于病变累及距下关节、距舟关节和跟骰关节而舟楔关节没有受累的患者［4］。行关节融合术后，对于髂骨植骨还是不能很好融合、行走尚有疼痛者可以行带血管蒂骨瓣移植进行融合，以提高融合率［5］。在进行距-舟-楔关节融合时，采取空心钉加钢板螺钉双重固定系统，使得融合后关节更加稳定，防止关节内产生微动，以提高关节融合率。

例如，记叙文写作教学过程中，两个平行班同样学习复杂记叙文，其中一个班为理科较强的班，接受能力强，文学感受力差；另一个班各科成绩均较差，但学习兴趣浓厚。于是我们设计了不同的教学环节。接受能力强的班从小说阅读中汲取记叙文写作知识，仿写、改写经典短篇小说，在阅读和仿写过程中自主领悟记叙文情节安排、人物塑造、环境描写的方法。另一个班从写观察日记练起，规定学生观察生活的方方面面，完成记叙文写作技巧的单元训练，然后在教师指导下完成复杂记叙文的构思和成文训练。

中西医联合治疗组则采取西药加上清迈解毒饮治疗。药物组成：黄芩10g，地丁15g，苦参10g，丹皮10g，赤芍10g，桑白皮10g，金银花15g，茵陈15g，马齿苋30g，连翘10g，大便干结的患者加决明子和熟军；月经不调加益母草和郁金，每天1剂分两次，治疗4周。

2.2.4 富集分析及“化合物-靶点-通路网络” 基于R语言对作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，显著性排名前20的结果如图6所示。GO功能主要涉及对脂多糖的反应、氧化应激反应、类固醇激素反应、酮反应、细胞增殖、肝再生等。共富集到96条KEGG通路，主要涉及Toll 样受体(TLR)、TNF、PI3K/Akt、MAPK、Caspase细胞凋亡信号级联通路等信号通路。“化合物-靶点-通路网络”如图7，体现了柴胡干预肝纤维化具有多成分、多靶点、多途径的特点。

3 讨论

2.2.2 柴胡干预肝纤维化的作用靶点及网络 柴胡与肝纤维化的共同靶点即为柴胡干预肝纤维化的作用靶点，如图1所示，共有146个。“化合物-靶点-疾病”网络如图2所示。经拓扑学分析，12种活性成分的度值如表1所示，其中槲皮素(Quercetin，MOL000098)、山奈酚(Kaempferol ，MOL000422)、异鼠李素(Isorhamnetin，MOL000354)和豆甾醇(Stigmasterol，MOL000449)的度值较高。柴胡干预肝纤维化的靶点PPI网络如图3所示，共筛选到核心靶点27个，如表2所示，度值前十的靶点如表3所示。

本研究发现，柴胡中的槲皮素、异鼠李素、山奈酚、豆甾醇、荜澄茄素等活性成分对应的作用靶点较多，或在治疗肝纤维化中发挥重要作用。研究发现，槲皮素可抑制肝星状细胞的活化，调节TGF-β1/Smads和PI3K/Akt信号通路减轻肝纤维化

；异鼠李素可抑制TGF-β/Smad信号通路、减轻氧化应激以抑制肝纤维化

；荜澄茄素可通过抗炎、降低脂质过氧化以抑制肝纤维化

。此外，研究报道，豆甾醇、矮牵牛素、α-菠菜甾醇、山柰酚等具有抗炎、抗氧化、抗肝纤维化和免疫调节等作用

。

在PPI网络中，AKT1、MAPK8、IL-6、MYC、EGF、CCND1等27个靶点为柴胡干预肝纤维化的核心靶点。分子对接模拟验证结果显示，度值位居前10的核心靶点能与活性成分形成较为稳定的构象，具有良好的结合活性，进一步印证了其在网络中的重要地位。AKT1 和MAPK8分别是PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路的重要靶点，均参与调解肝星状细胞的活化、增殖和凋亡等过程。IL-6介导肝损伤的急性期反应，也是促纤维化细胞因子；EGF有助于肝星状细胞活化为肝成纤维细胞，促使其大量表达EGFR，引起该细胞的增殖与迁移反应

；肝细胞中的MYC基因过度表达可促进肝星状细胞的活化；CCND1可调控细胞增殖、DNA修复及细胞迁移等。

柴胡的核心靶标与肝再生关系密切。肝脏是人体重要的代谢器官，具有强大的再生能力，这与中医“肝主生发”理论不谋而合。李瀚旻等

研究认为，中医“肝应春木,主生发”实际是对肝再生能力的认识，“肝主生发”的现代内涵是指肝有独特的发生发育和再生修复能力，肝再生是“肝主生发”的重要生物学基础。肝损伤后通常有两种再生方式，分别由肝细胞和肝祖细胞介导，其中，肝细胞是肝再生的主要参与者。柴胡的核心靶标如RELA、IL-6、VEGFA、EGFR、FOS、ESR1、CCND1、MYC、MAPK8、CASP8、PRKCA等参与肝再生过程。RELA在肝发育和再生过程中起着重要作用

，缺乏RELA会导致小鼠的肝细胞变性和胚胎致死

；IL-6是肝再生的主要驱动因子

；VEGFA能促进再生肝中的血管新生，以及内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖

；EGFR是肝再生的调节剂，促进肝细胞周期中G1期向S期转化

；ESR1可作为肝细胞的促分裂原，诱导肝细胞增殖

；FOS、CCND1是细胞增殖、分化和转化的调节因子；C-myc和C-fos是 Ras-Raf-MEK信号级联的肝再生特异性转录因子

。此外，MAPK8、CASP8、MYC、CCND1、PRKCA等几个靶点或参与肝干细胞介导的肝再生

。

受热面上集箱找正过程中，要考虑沉降，把标高适当提高。在垂直水冷壁与螺旋管圈水冷壁的过渡过程中，要严格控制垂直水冷壁四圈的标高一致，为下面螺旋管圈水冷壁的对口创造条件。螺旋管圈水冷壁对口前中间集箱及下面的接口管座的标高也要严格找正。如果下面的管座焊口不平齐，需用坡口机修齐后再进行施焊。

GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果表明，作用靶点主要涉及炎症、氧化应激、细胞增殖与凋亡、肝再生等生物学过程及调节TNF信号通路、MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路等。TLR、TNF、MAPK及PI3K/Akt信号通路通过参与细胞增殖、分化和凋亡等多个生物学过程影响肝纤维化的进程。Roh等研究发现，内毒素性肝损伤可激活TLR，从而启动炎性免疫应答，诱导肝纤维化。Varela-Rey等

研究显示，TNF-α减少大鼠肝星状细胞内P38 MAPK磷酸化，进而调节Ⅰ型胶原表达；Lechuga等

发现，P38 MAPK信号通路参与TGF-β1介导的基质金属蛋白酶13表达。PI3K/Akt信号通路调控细胞外基质的降解、影响肝星状细胞的活化及调节肝窦毛细血管化等。此外，MAPK/ERK信号通路对于肝细胞增殖周期中的G1至S期是必需的，并对肝祖细胞的增殖和集落形成至关重要

。

4 结语

长期以来，肝纤维化的治疗多强调采用反向抑制的策略，如抑制肝星状细胞的活化与增殖，减少细胞外基质沉积等，正向促进肝再生修复的研究却甚少，而肝再生能力又是决定肝纤维化趋向康复或恶化的关键环节。本研究发现，柴胡“推陈致新”作用与现代再生理念相合，并通过网络药理学分析发现，柴胡或在抑制肝纤维化的同时，能促进肝再生修复，进一步推测柴胡的“推陈”——宣畅气血、行郁散结、和解表里等或与柴胡的核心靶标AKT1、MAPK8、RELA、IL-17、TNF-α、PPARG等抑制肝星状细胞活化，CASP3、CASP8诱导肌成纤维细胞凋亡，MMP-2、MMP-9降解细胞外基质相关；柴胡的“致新”——生发少阳、疏利肝胆、助脾胃运化，促进气血化生等或与核心靶标RELA、IL-6、VEGFA、EGFR、FOS、ESR1、CCND1、MYC、MAPK8、PRKCA等促进肝细胞再生相关。

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