基于网络药理学探讨健脾益气与活血化瘀药物配伍治疗原发性肝癌的协同机制*

原发性肝癌(肝癌)是临床上最常见恶性肿瘤之一，且呈现高危群体年轻化的倾向。中西医结合治疗是当前治疗肝癌的基本模式。中医药治疗肝癌，重在整体调节，配合手术、经皮肝动脉化疗栓塞术、消融、放化疗、靶向治疗等手段，可起到“增效减毒”作用。中医认为，肝癌是在机体正气亏虚的基础上，外邪侵袭或情志失调致肝失条达，气机不畅，久则血瘀、痰凝、毒结而发病。肝癌病性属本虚标实，病位在肝，与脾密切相关。《金匮要略》云：“见肝之病，知肝传脾，当先实脾。”肝病则木郁，木郁则横逆脾土，致脾气虚弱，运化失职。脾为气血生化之本，脾虚则气弱；气为血之帅，气虚则无力助血运行,血行迟缓；加之肝癌起病多伴情志失调，肝郁气滞，气不行则血停，瘀血阻滞肝络日久而形成积证。《医林改错》亦云：“结块者，必有形之血也。”肝癌本虚以脾虚为主,标实则以血瘀多见。鉴于此，课题组以健脾化瘀为法，应用健脾益气药与活血化瘀药配伍用于肝癌综合治疗，取得一定疗效

，而其药效的作用机制尚未阐明。

中药具有多成分、多靶点、多途径的作用特点。网络药理学可以建立中药复杂成分的分子网络与多重靶点、疾病之间的互作关系，从多靶点、多通路的角度实现药物作用的综合分析

。分子对接是通过受体的特征及受体与药物分子之间的相互作用方式来预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法

。本研究通过网络药理学筛选出健脾益气与活血化瘀配伍治疗肝癌的主要活性成分及相关靶点、通路，采用分子对接法将中药主要活性成分与关键靶点蛋白进行对接，探讨健脾益气与活血化瘀配伍多成分、多靶点、多途径治疗肝癌的作用机制，为临床应用提供依据，为后续机制研究提供思路和参考。

1 方法

1.1 获取中药活性成分与潜在靶点 应用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，以“人参”“黄芪”“党参”“丹参”“莪术”“川芎”为检索词，收集六味药物所有相关的化学成分。并选择口服生物利用度(OB)≥30%和药物相似性(DL≥0.18)作为化合物分子的筛选条件，以此遴选每一味药物可能的活性成分。之后分别将健脾益气药人参、黄芪、党参相关的活性成分和活血化瘀药丹参、莪术、川芎的活性成分合并去重，筛选出二者交集的共同活性成分。并进一步通过TCMSP数据库搜索筛选出中药活性成分相关的潜在靶点。

由上图可看出，直接积分法可以得到方程的直接解析解.从曲线可看出实际状态折刀杆角加速度出现明显非线性特征.间隙角角加速度远大于折页机构各构件角加速度最大值，达到100倍左右；而且它们的变化变化迅速且没有规律，具有很强的随机性.随着曲柄转速的进一步上升，折页机构的加速度动态响应将表现出明显的混沌状态.该仿真验证了直接积分法的正确性.

1.2 获取肝癌相关靶点，构建韦恩图 应用GeneCards数据库和OMIM数据库，以“liver cancer”为关键词，检索肝癌相关靶点。将肝癌相关靶点与健脾益气药、活血化瘀药对应的靶点映射，构建韦恩图。

1.3 构建“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络 将中药活性成分的对应靶点和肝癌相关靶点进行匹配，获得两者的共同靶点即为中药抗肝癌的关键靶点。采用Cytoscape3.7.1软件构建“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络。

1.4 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 将中药与肝癌共同靶点导入DAVID 6.8数据库， 物种选择人类。GO分析时选择生物学过程(BP) 、细胞组成(CC) 和分子功能(MF)3个模块进行功能注释。根据校正后

值进行排序，分别选择GO富集排名前20的生物学功能及KEGG分析靶点富集前20的通路，进行条形图展示。

2.1 筛选中药活性成分和靶点 通过检索TCMSP数据库，获得与健脾益气药人参、黄芪、党参相关的活性成分61个，与活血化瘀药丹参、莪术、川芎相关的活性成分75个。按照同时满足OB≥30%和 DL≥0.18的条件筛选并筛除重复成分后，最终得到健脾益气药 46个活性成分，活血化瘀药61个活性成分。两种中药共有活性成分5个，分别为FA、luteolin、perlolyrine、hederagenin、3-beta-Hydroxymethyllenetanshiquinone。进一步检索TCMSP数据库，选择“Ingredients”，得到健脾益气药活性成分对应靶点173个，活血化瘀药活性成分对应靶点103个，两种中药共同靶点93个。

2.5 KEGG通路富集分析 关键靶基因与KEGG通路进行映射，共富集156条通路，根据校正后

值进行排序，选择前20个进行条形图展示(图4)。如图4示，健脾益气药和活血化瘀药作用靶点涉及的通路富集主要有乙型肝炎(Hepatitis B，30个基因)、人类巨细胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection，30个基因)、癌症信号通路(Proteoglycans in cancer，29个基因)、血流剪切应力和动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis，27个基因)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection，26个基因)、Epstein-Barr virus infection(EB病毒感染，25个基因)等，且与肺癌(小细胞肺癌及非小细胞肺癌)、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、结直肠癌等多种肿瘤密切相关。

2.4 GO功能富集分析 通过关键靶点，共富集189个生物学过程和功能，根据校正后P值进行排序，选择前20个进行条形图展示(图3)。如图3示，健脾益气药和活血化瘀药作用靶点GO富集排名靠前的生物学功能主要为：脱氧核糖核酸(DNA)结合转录激活因子活性和核糖核酸(RNA)聚合酶Ⅱ特异性(DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase Ⅱ-specific，21个靶点)、泛素样蛋白连接酶结合(ubiquitin-like protein ligase binding，16个靶点)、酰胺结合(amide binding，16个靶点)，肽结合(peptide binding，15个靶点)、核受体功能(nuclear receptor activity，13个靶点)、转录因子活性(transcription factor activity，direct ligand regulated sequence-specific DNA binding，13个靶点)等。

2 结果

1.5 构建蛋白质相互作用网络 利用String数据库平台(https://string-db.org/Version 10.5)预测蛋白相互作用关系。将中药关键靶点导入String数据库，将研究物种选择为人类， 获得蛋白质互作关系，将结果以TSV格式导出。根据度值筛选出排名前20的关键靶点蛋白制作条形图。

图6中，x轴表示饱和度，y轴表示信噪比，z轴表示测距时间精度，E1、E2分别表示窗宽自适应形心修正算法和传统形心算法的最大误差，可以看出随着饱和度的提高，当饱和度超出200%时，传统算法的精度开始出现偏差，之后偏差不断增大，不能满足系统测距精度的要求；在信噪比为10 dB、饱和度为1 000%时，传统形心算法的最大误差为3.76 ns，窗宽自适应形心修正算法最大误差为0.3 ns，相比于传统形心算法精度提高92%.

2.2 获取肝癌相关基因和构建韦恩图 通过检索OMIM和GeneCards数据库，共筛选出14 664个肝癌相关靶点，与健脾益气药和活血化瘀药对应的靶点映射，构建韦恩图(图1)。如图1示，健脾益气药治疗肝癌作用靶点161个，活血化瘀药治疗肝癌作用靶点95个，两种中药治疗肝癌的共同作用靶点86个。

2.7 主要中药活性成分与关键靶点蛋白的分子对接 根据蛋白质相互作用网络，选择度值前5的中药活性成分槲皮素、豆甾醇、木犀草素、山奈酚、木犀草素与度值前5的关键靶点AKT1、TP53、IL-6、VEGFA、CASP3进行分子对接验证。一般认为，对接得分小于-4.25 kcal/mol表示两者间有一定的结合活性，小于-5.0 kcal/mol表示有较好的结合活性，小于-7.0 kcal/mol表示有强烈的结合活性

。本研究结果显示,5个主要中药活性成分与5个关键靶点的对接得分均小于-5.0 kcal/mol，提示均有较好的的结合活性(表2)。其中有8组的对接得分小于-7.0 kcal/mol，得分从低到高依次为豆甾醇与AKT1、常春藤皂甙元与AKT1、木犀草素与AKT1、槲皮素与AKT1、常春藤皂甙元与CASP3、山奈酚与AKT1、常春藤皂甙元与TP53、豆甾醇与CASP3(图7)。

对表1结果进行分析可见，在使用二阶导数作为数据预处理方法时，未去皮净制样本的平均相关系数（r）已降至50%以下；净制完全样本的值仍保持在97%以上；而未净制完全样本值已降至85%以下。故可选定二阶导数作为求导处理方法。

2.6 构建蛋白质相互作用网络 在STRING数据库构建蛋白质相互作用网络(PPI)。如图5示，此网络包含169个节点，2 399条边，平均节点度值为28.4。根据度值筛选出排名前20的关键靶点，分别是AKT1、TP53、IL-6、VEGFA、CASP3、EGFR、JUN、MAPK8、MYC、TNF(图6)。

2.2.9.3 发病条件。禾草离蠕孢在夏季湿热条件下侵染牧草；当气温升至20 ℃左右时，只发生叶斑，随着温度升高，叶斑越明显。当气温升至29 ℃以上且高湿时，表现严重叶枯并出现茎腐、茎基腐和根腐，造成病害流行。

1.6 中药主要活性成分与关键靶点蛋白的分子对接 根据上述筛选出的中药主要活性成分及关键靶点蛋白，从TCMSP数据库下载中药活性成分3D结构。使用AutodockTools1.5.6打开配体小分子，加氢、加电荷、检测配体的root、进行可旋转键的搜寻与定义，保存文件。从PDB数据库(https://www.rcsb.org)下载关键靶点蛋白的3D结构，使用AutodockTools1.5.6打开，添加所有的氢原子、计算Gasteiger电荷、合并非极性氢后，将其定义为受体并保存为pdbqt文件。确定Vina分子对接的坐标和盒子大小，为了增加计算的准确度，将参数exhaustiveness设置为20，除了特别说明，其他参数均采用默认值。采用Autodock vina 1.1.2进行半柔性对接，选取affinity最佳的构象，作为最终的对接构象。选取对接结合能量最低的构象用于对接结合模式分析，并使用Pymol进行作图。

改革开放初期，我国食品安全监管的重心主要放在“食品卫生”方面。1978年，经国务院批准同意，卫生部牵头同其他有关部委组成“全国食品卫生领导小组”，组织对农业种植养殖、食品生产经营和进出口等环节的食品污染现象开展治理工作。但这一时期的监管内容较为简单，种植养殖、生产加工、市场流通、餐饮消费等方面存在的问题仍较为突出。

2.3 构建“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络图 通过String数据库获取中药活性成分与肝癌相关靶点的相互关系，并将数据导入Cytoscape 3.2.1软件，构建“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络图(图2)。网络图中紫色代表健脾益气药的活性成分和靶点，黄色代表活血化瘀药的活性成分和靶点，红色代表两种中药共有的活性成分和靶点，灰色连线代表各节点间的相互关系。如图2示，该网络包含273 个节点和1 586条边，代表中药活性成分171个及肝癌相关靶点102个。如表1示，度值(degree)前5的中药活性成分为槲皮素(quercetin)、豆甾醇(stigmasterol)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、常春藤皂甙元(hederagenin)，其中木犀草素、常春藤皂甙元为两种中药共有成分。

3 讨论

中医认为，肝癌病性属本虚标实，病位在肝，与脾密切相关。课题组以健脾化瘀为法，应用健脾益气药与活血化瘀药配伍，自拟参芪化瘀方用于肝癌综合治疗。参芪化瘀方主要由党参、北芪、丹参、莪术、八月札等13味药组成。前期临床研究发现，该方能明显改善肝癌患者经导管肝动脉化疗栓塞(TACE)术后的消化道反应、骨髓抑制、肝功能损害等不良反应，改善患者机体功能状态，提高其生活质量

。王俊镔等

进一步研究发现，参芪化瘀方联合一般内科治疗，可降低肝癌患者的全血粘度、血沉、红细胞刚性指数、血小板水平等，改善患者血液高粘高凝状态。基于临床上健脾益气药与活血化瘀药配伍治疗肝癌的有效性，本研究采用网络药理学和分子对接法探索健脾益气药与活血化瘀药配伍治疗肝癌的活性成分和分子作用机制，试图为参芪化瘀方的后续机制研究提供思路，为其临床应用提供依据。

通过查阅各种文献资料，发现研究农业循环经济的文章并不多，且较少运用DEA相关方法进行研究。目前国内外学者研究所采用的大多是传统的DEA方法，较少学者使用DEA的其他研究模型，而更少有使用交叉DEA效率模型进行农业循环经济的研究者。本文通过选取湖北省13个主要市州作为目标决策单元，运用交叉DEA的分析方法，对各个地区的农业循环经济发展水平做出评价，并提出相关发展建议，从理论上为发展湖北省农业循环经济提供科学性的指导。

本研究通过检索数据库，获得健脾益气药和活血化瘀药共同活性成分5个，其中木犀草素、常春藤皂甙元为两种中药抗肝癌共同成分。木犀草素是一种天然黄酮类化合物。杨培伟

等发现，木犀草素能抑制肝细胞癌的生长、浸润和转移，对肝细胞癌有增效、增敏、减毒、抗氧化和抗突变的作用，可以通过多机制、多途径、多靶点抗肝细胞癌。常春藤皂甙元是一种齐墩果烷型三萜皂苷的单体化合物。白雪

等发现，常春藤皂甙元在体内和体外均具有明显的抑制肝癌细胞生长和增殖的作用，这可能与常春藤皂甙元能够激活细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径密切相关。本研究获得健脾益气药和活血化瘀药治疗肝癌共同作用靶点86个，如PTGS1、VEGFA、TP53、IL-6、IL-10等，涉及生长因子调控、肿瘤血管生成、细胞凋亡、免疫功能、炎症反应等方面。

GO功能富集分析包含3个部分：细胞组分、分子功能和生物过程，共确定189个条目，主要涉及转录相关功能、核受体功能、泛素化等生物学功能。通路富集分析共富集156条通路:与肝病直接相关的通路包括Hepatitis B、Hepatitis C、Non-alcoholic fatty liver disease 等，与炎症相关的通路包括TNF、 HIF-1、PI3K-Akt、IL-17等，与免疫相关的通路包括JAK-STAT、NF-κB、B cell receptor、T cell receptor等。提示健脾益气药和活血化瘀药通过参与调控多种生物学过程发挥抗癌作用。

通过构建蛋白质相互作用网络，筛选出关键靶点：AKT1、TP53、IL-6、VEGFA、CASP3、EGFR、JUN、MAPK8、MYC、TNF等。研究表明，AKT1 在肝细胞癌细胞系的增殖和迁移中起重要作用

。沉默AKT1表达可能通过抑制SMMC-7721和HepG2细胞中NF-κB的激活下调 MMP-2、MMP-9的表达水平和催化活性，从而抑制肝癌细胞的增殖及迁移。TP53是最早发现的肿瘤抑制基因之一，约20%～40%的肝癌患者检测到TP53基因突变。TP53基因频繁在肝癌中发生遗传突变而失活，是导致肝癌发病的抑癌基因之一，并且其突变频率与肝癌的发展阶段有关

。IL-6是一种可以由多种细胞产生的多效应细胞因子，IL-6基因的异常活化和 IL-6的分泌异常调节可能参与肿瘤的增殖、迁移和粘附。研究发现，异常活化的JAK/STAT3信号通路参与肝癌的发生及发展。而IL-6可以激活JAK/STAT3信号通路并使STAT3发生磷酸化，进一步调控其下游基因的转录，参与调节细胞的增殖、分化和凋亡等重要的生物学过程

。VEGFA是肿瘤血管生成中重要的因子之一，它通过与VEGF受体结合,激发一系列信号通路，促进内皮细胞的增殖、生存和转移，从而刺激血管的生成

。研究发现，VEGFA在肝癌组织和血清中呈显著高表达并与其临床分期和预后有关,是肝癌侵袭性、肝癌患者术后复发独立预后指标

。课题组前期免疫组化提示

，参芪化瘀方能抑制H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织中VEGF、p53表达。结合本研究PPI网络图及分子对接结果，进一步提示VEGF、p53信号通路可能是该方抗肝癌的作用机制之一。

综上，本研究结果显示，健脾益气药和活血化瘀药的活性成分靶点分布于不同的通路，通过各通路协同发挥抗肝癌作用，符合抗癌中药多成分、多途径、多靶点的作用特点，也提示健脾益气药和活血化瘀药配伍，是以整体协同的方式发挥抗肝癌作用的。这也为我们在临床上使用健脾益气药和活血化瘀药配伍治疗肝癌提供了一定的依据。通过构建“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络及PPI，获得度值前5的活性成分及靶点，作为中药抗肝癌的重要成分及关键靶点，对后续机制研究及临床应用具有重要指导意义。

[1]谭明.参芪化瘀方配合TACE术治疗原发性肝的疗效观察及机理探讨[D].广州中医药大学,2009.

[2]王俊镔.参芪化瘀方对原发性肝癌血瘀证血液流变学影响的临床观察[D].广州中医药大学,2019.

[3]耿胜男,杨莉,李阳杰等.基于网络药理学的干姜抗癌作用机制分析[J].中药材，2019，42(11):2659-2668.

[4]邓燕君,刘博文,贺桢翔,等.基于网络药理学和分子 对接法探索藿香正气口服液预防新型冠状病毒肺炎(COVID-19)活性化合物研究[J].中草药,2020,51(5):1113-1122.

[5]Kun YH,Samik G,Hiroaki K,

. Combining machine learning systems and multiple docking simulation packages to improve docking prediction reliability for network pharmacology[J].PLoS ONE,2013,8(12):e83922.

[6]杨培伟,张树辉.木犀草素抗肝细胞癌作用及机制的研究进展[J].中药药理与临床,2018,34(1):190-193.

[7]白雪.常春藤皂甙元抗肝癌作用研究[D].西北农林科技大学,2017.

[8]陈晶.靶向封闭AKT1抑制肝癌细胞增殖和迁移的研究[D].青岛大学,2017.

[9]段磊.MiR-146a异常表达及其单核苷酸多态位点rs2910164与肝癌易感性的相关研究[D].武汉大学,2018.

[10]Guichard,Cécile,Amaddeo G,

.Integrated analysis of somatic mutations and focal copy-number changes identifies key genes and pathways in hepatocellular carcinoma[J].Nature Genetics,2012,44(6):694-698.

[11]Fujimoto A,Totoki Y,Abe T,

.Whole-genome sequencing of liver cancers identifies etiological influences on mutation patterns and recurrent mutations in chromatin regulators[J].Nat Genet,2012,44(7):760-764.

[12]Frank S,Hussain P,Lorne J,

.TP53 and liver carcinogene-sis[J].Human Mutation,2003,21:201-216.

[13]徐倩.一个新的IL6R抗体“HC6R1”抗肝癌的研究[D].苏州大学,2016.

[14]Schroder K,Tschopp J.The inflammasomes[J].Cell,2010,140(6):821-832.

[15]何莺华.NLRC5在肝癌细胞中对血管内皮生长因子A(VEGF-A)的表达调控及其机制研究[D].安徽医科大学,2017.

[16]苏宏,叶江琳,刘慧,等.参芪化瘀方对H22肝癌细胞p53基因表达的影响[J].新中医,2011,043(12):111-113.