木鳖子调控circRNA_002178表达抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用机制研究

近年来，中草药的抗肿瘤作用已成为研究热点

。木鳖子(MC)属于葫芦科苦瓜属植物，其主要包含甾体类、烯烃类等成分，具有抗癌、抗炎等作用

。环状RNA(circRNA)是一种5′与3′端以共价键结合形成的RNA分子，具有稳定性、组织特异性等特点，并可通过结合微小RNA(miRNA)调控肝癌等肿瘤细胞增殖及转移过程

。环状RNA_002178(circRNA_002178)在乳腺癌中表达水平升高，下调其表达可抑制乳腺癌发展进程

。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(Akt)信号通路在肝癌细胞增殖及迁移过程中发挥重要调控作用

。但木鳖子是否可通过调控circRNA_002178表达及PI3K/AKT信号通路发挥作用尚未可知。因此，本研究主要探讨木鳖子对肝癌细胞的影响，探究其对circRNA_002178及PI3K/AKT信号通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 木鳖子(宁夏香草生物)；人肝癌细胞系MHCC97-H(美国ATCC)；Lipofectamine2000、Trizol试剂、反转录试剂盒(美国Thermo Fisher)；荧光定量检测试剂盒(北京天根生化)；circRNA_002178小分子干扰RNA(si-circRNA_002178)、乱序无意义阴性序列(si-NC)(广州锐博生物)；pcDNA3.1(上海远慕生物)；CCK-8检测试剂盒(上海宇淳生物)；Transwell小室(美国Corning)；Matrigel基质胶(美国BD)。

1.2 实验分组 MHCC97-H细胞分别加入含有不同浓度(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml)木鳖子的培养基处理24 h

，分别记作MC-L组、MC-M组、MC-H组。同时将正常培养的细胞作为Con组。分别将si-NC、si-circRNA_002178转染至MHCC97-H细胞，分别记作si-NC组、si-circRNA_002178组。分别将pcDNA、pcDNA-circRNA_002178转染至MHCC97-H细胞，分别加入含有浓度为200 μg/ml木鳖子的培养基处理24 h，分别记作MC-H+pcDNA组、MC-H+pcDNA-circRNA_002178组。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖 取各组MHCC97-H细胞接种于96孔板(1×10

个/孔)，加入CCK-8溶液(10 μl/孔)，置于培养箱培养2 h，应用酶标仪检测各孔光密度值(OD)，计算细胞存活率(%)=(实验组OD/对照组OD)×100%。

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2.2 木鳖子对肝癌MHCC97-H细胞中circRNA_002178表达量的影响 与Con组比较，MC-L组、MC-M组、MC-H组circRNA_002178的表达水平降低(

<0.05)，且呈剂量依赖性(

<0.05)，见表2。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中circRNA_002178的表达水平 采用Trizol法提取细胞总RNA，检测RNA浓度，反转录合成cDNA。qRT-PCR扩增反应体系参照荧光定量检测试剂盒说明书并检测circRNA_002178相对表达量。

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1.6 蛋白免疫印迹(Western blot)检测MMP-2、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白表达 提取MHCC97-H细胞总蛋白，SDS-PAGE分离蛋白，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入MMP-2(1∶800)、MMP-9(1∶800)(美国CST)、p-PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)(美国Santa Cruz)一抗稀释液与二抗稀释液(武汉艾美捷)，滴加ECL，暗室内曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.4 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 使用培养基稀释Matrigel基质胶，随后加入Transwell小室的上室(40 μl/孔)，置于培养箱孵育5 h，将各组MHCC97-H细胞加入Transwell小室的上室(5×10

个/孔)，将含有10%胎牛血清的培养基加入Transwell小室的下室(600 μl/孔)，分别采用多聚甲醛固定(20 min)与0.1%结晶紫染液染色(10 min)。细胞迁移实验与侵袭实验中后续实验步骤相同，置于显微镜下观察迁移细胞数与侵袭细胞数。

2.1 木鳖子对肝癌MHCC97-H细胞增殖、迁移及侵袭的影响与Con组比较，MC-L组、MC-M组、MC-H组细胞增殖、迁移及侵袭能力降低(

<0.05)，且呈剂量依赖性(

<0.05)，见图1、表1。

2 结果

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2.4 circRNA_002178过表达降低木鳖子对MHCC97-H细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用 与MC-H+pcDNA组比较，MC-H+pcDNA-circRNA_002178组细胞增殖、迁移及侵袭能力明显增强(

<0.05)，见图3、表4。

2.3 干扰circRNA_002178表达对MHCC97-H细胞增殖、迁移及侵袭的影响 与si-NC组比较，si-circRNA_002178组细胞增殖、迁移及侵袭能力降低(

<0.05)，见图2、表3。

2.5 各组MHCC97-H细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达 与Con组比较，MC-H组、si-circRNA_002178组p-PI3K、p-Akt蛋白水平显著降低(

<0.05)；与MC-H+pcDNA组比较，MC-H+pcDNA-circRNA_002178组p-PI3K、p-Akt蛋白水平显著升高(

<0.05)，见图4、表5。

3 讨论

中草药在肝癌治疗方面已取得一定进展，可抑制肿瘤细胞增殖及减缓疾病进展，并可延长患者生存期及提高患者生活质量

。但关于中草药在肝癌治疗过程中的作用机制尚未阐明。circRNA可调控miRNA或相关基因表达，还可调节基因转录后水平，并可参与肝癌发生及发展过程

，但中草药是否以circRNA为作用靶点从而发挥作用尚未阐明。

木鳖子可抑制食管癌、乳腺癌等肿瘤发展进程

。本研究结果显示不同剂量的木鳖子处理后肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力明显降低，提示木鳖子可抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭，且呈剂量依赖性。MMP-2、MMP-9高表达可降解细胞外基质沉积而增强细胞迁移及侵袭能力

。本研究结果显示不同剂量的木鳖子处理后可明显降低MMP-2、MMP-9的表达水平。研究表明circRNA_002178表达水平升高可促进肺腺癌发展进程

。本研究结果显示不同剂量的木鳖子处理后可明显降低circRNA_002178的表达水平，且随着药物剂量的增加而显著降低，提示木鳖子可能通过调控circRNA_002178的表达从而发挥抗肝癌的作用。本研究进一步分析显示干扰circRNA_002178的表达后细胞增殖、迁移及侵袭能力明显减弱，提示木鳖子可能通过下调circRNA_002178的表达从而抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭。

为进一步验证木鳖子是否可通过调控circRNA_002178的表达而发挥作用，本研究将pcDNA-circRNA_002178转染至肝癌细胞，使用高剂量的木鳖子处理后，细胞存活率明显升高，迁移及侵袭细胞数明显增多，提示circRNA_002178过表达降低木鳖子对MHCC97-H细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。研究表明PI3K/Akt信号通路中PI3K被激活形成磷酸化p-PI3K，p-PI3K可促进下游基因Akt发生磷酸化形成p-Akt从而促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭，并抑制细胞凋亡，通过抑制PI3K/Akt信号通路的活化可明显抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭

。本研究结果显示木鳖子处理后肝癌细胞中p-PI3K、p-Akt的表达水平降低，干扰circRNA_002178的表达后肝癌细胞中p-PI3K、p-Akt的表达水平降低，而circRNA_002178过表达可明显提高p-PI3K、p-Akt的表达水平，提示circRNA_002178可能正向调控PI3K/Akt信号通路，而木鳖子可能通过下调circRNA_002178的表达而负向调控PI3K/Akt信号通路从而减弱肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

综上所述，木鳖子可通过抑制circRNA_002178的表达而减弱肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，其作用机制与抑制PI3K/Akt信号通路的活化有关，circRNA_002178可能作用肝癌靶向治疗的潜在靶点，可为进一步揭示木鳖子抗肿瘤的分子机制奠定实验基础。

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