基于PI3K/AKT通路探讨洋甘菊提取物改善PCOS大鼠生殖功能的研究

杜 丹，樊荣华

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）影响育龄妇女生殖功能，目前尚不明确其发病原因与机制。该病主要的特点是高雄激素血症，患者可表现为不出现闭经情况但排卵已经停止，是育龄期的女性不孕原因之一[1-2]。PCOS患者子宫内膜变薄，其容受性与内膜血流量下降，尚未明确机制。磷酸酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 通路（phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B，PI3K/AKT）为常见通路，其中PI3K 为异源二聚体，雌激素结合细胞需激活PI3K，有助于AKT 表达；AKT 活化后可扩张血管。PI3K/AKT 活化可提高子宫内膜生长，促进胚胎分化[3-4]。中医将PCOS 归属于“月经不调、不孕症”范畴，肾虚为本、痰湿血瘀为标。对于该类型妇科疾病，以补肾中药材为最佳[5]。洋甘菊为东欧与南欧地区常见药物植物，主要活性成分有酚类、类黄酮、植物雌激素[6]。洋甘菊提取物具有抗炎、抗氧化、抗病毒、保护血管等作用[7]。本研究通过建立PCOS大鼠模型以观察其高低浓度的洋甘菊提取物对大鼠生殖功能、PI3K/AKT 蛋白表达的机制进行分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 55 只成年雌性大鼠购于四川省医学科学院实验动物中心，SPF 级，合格证号SCXK(川)2020-24，体质量100～200 g，鼠龄8～10 周。适应性饲养2 周后开始实验。本实验经宜宾市第三人民医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及分组 参照[8]方法造模，对大鼠皮下注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)（购自丽珠制药厂）30 U，每日1次，持续注射22 d；同时每日注射1 次胰岛素（购自武汉优尔生科技有限公司），前11 d皮下注射0.5 U，后逐渐增加剂量至6 U，维持注射至第22 天。大鼠每日注射药物后检查阴道涂片，连续观察20 d，当大鼠动情周期完全无变化则表示造模成功[8]。取10 只大鼠作为假手术组，剩余大鼠按模型制备成功造模后分为PCOS 组、洋甘菊提取物低剂量组及高剂量组，各15 只。给药方式：造模后1 d 进行灌胃给药，假手术组（于造模期间为其注射生理盐水，持续注射22 d）与PCOS组以4 mL/kg标准给予生理盐水；低剂量组以45 mg/mL 标准给予洋甘菊提取物（购自南京道斯夫生物科技有限公司），高剂量组以75 mg/kg 标准灌胃，两组给药体积均为4 mL/kg；每日1 次，持续给药30 d。洋甘菊提取物浓度高低参考文献[6]确定。取材：最后1 次给药2 h 后麻醉处理；称重，于腹主动脉部位取血置于离心管内，离心后取血清，冷冻保存。摘除大鼠子宫称重，并放于多聚甲醛中固定；子宫指数=子宫重量/体质量。

1.2.2 血清样本检测 取冷冻保存的血清溶解，放射免疫分析法检测血清的促卵泡生成激素（follicle stimulating hormone，FSH）、促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、孕酮（progesterone，P）、雌二醇（estradiol，E2）、睾酮（testosterone，T）含量。

1.2.3 苏木精-伊红( hematoxylin-eosin，HE )染色 取子宫组织固定于多聚甲醛溶液内，脱水，在二甲苯中透明，制切片；切片用苏木素染色15 min后使用磷酸缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3 次；伊红染色后PBS清洗透明，镜下观察病理变化。

1.2.4 卵巢组织观察 取大鼠卵巢部位的组织，通过甲醛实施固定，再通过石蜡包埋、HE给予染色后放置在光学显微镜下进行病理形态观察。

1.2.5 免疫组化检测 免疫组化检测子宫容受性指标白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)与整合素β3：雌激素检测后各组选取5 只大鼠，当日下午将大鼠放入笼内，各个笼里放雄性大鼠2 只，第2 天观测雌性大鼠的阴道情况，其中若发现了数量众多的精虫则确定妊娠首日，5 d 后处死雌鼠取其子宫，甲醛固定水化，静置30 min后加1%乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA），用山羊血清封闭；加抗LIF、整合素β3抗体，再加入二抗，复染封皮；于显微镜下选无交叉的5 个视野计算其光密度值（optical density，OD值）。

1.2.6 免疫印迹法检测 免疫印迹法对AKT、PI3K蛋白的表达情况进行检测：在子宫的组织内加适量的胰蛋白裂解液，通过离心处理，之后取上层液体加入样孔内；接下来经过电泳、转膜、浸泡TRIS 缓冲盐溶液(TRIS buffered saline solution，TBS)，反复采用PBS给予冲洗，分别向聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上滴加一抗兔抗鼠PI3K、AKT（1:500），二抗（1:1 000），杂交后再次冲洗3次，放入ECL工作液内检测，获取图像。

1.2.7 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)法检测 PCR 方式对组织中的AKT 、PI3K mRNA 表达进行检测：采用适量的胰蛋白酶消化大鼠的子宫组织，之后在低温条件下将其研磨成浆，将RNA 提取后用乙醇离心处理，冷冻保存；反应条件为：于98 ℃进行6 min；再于98 ℃下28 s，75 ℃下30 s，80 ℃下4 min，共55个循环。

1.3 统计学处理 应用SPSS20.0 软件，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间行t检验；多组间采用单因素方差分析；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量与子宫指数比较 与假手术组比较，PCOS组体质量与子宫指数显著上升，差异有统计学意义（F=39.410，P＜0.05）；与PCOS 组比较，洋甘菊提取物低剂量与高剂量组大鼠体质量与子宫指数显著下降，且高剂量组比低剂量组更低，差异有统计学意义（F=149.772，P＜0.05），表1。

表1 各组大鼠体征与子宫指数比较（±s）

表1 各组大鼠体征与子宫指数比较（±s）

与假手术组比较，#P＜0.05；与PCOS组比较，*P＜0.05；与洋甘菊的提取物低剂量组比较，&P＜0.05

组别假手术组PCOS组洋甘菊提取物低剂量组洋甘菊提取物高剂量组F P例数10 15 15 15体质量（g）197.32±10.21 235.64±11.15#223.46±10.17*203.64±9.31*&39.410＜0.001子宫指数（mg/g）1.02±0.05 2.54±0.16#1.95±0.17*1.12±0.34*&149.772＜0.001

2.2 各组大鼠激素水平比较 与假手术组比较，PCOS 组LH 水平显著上升，FSH、E2、P、T 水平下降，差异有统计学意义（F分别为32.331、27.140、16.732、22.251、25.593，P＜0.05）；与PCOS 比较，洋甘菊提取物低剂量与高剂量组LH 水平下降，FSH、E2、P、T 水平上升，且高剂量组激素水平改善更佳，差异有统计学意义（P＜0.05），表2。

表2 各组大鼠性激素水平比较（±s）

表2 各组大鼠性激素水平比较（±s）

与假手术组比较，#P＜0.05；与PCOS组比较，*P＜0.05；与洋甘菊的提取物低剂量组比较，&P＜0.05

组别假手术组PCOS组洋甘菊提取物低剂量组洋甘菊提取物高剂量组F P例数10 15 15 15 LH（U/L）6.01±1.51 12.91±2.83#8.12±1.87*7.25±1.04*&32.331＜0.001 FSH（mU/mL）1.46±0.23 0.88±0.16#1.10±0.21*1.39±0.16*&27.140＜0.001 E 2（ng/L）31.16±5.67 18.82±3.54#25.56±4.02*26.39±4.71*&16.732＜0.001 P（μg/L）51.32±8.56 32.16±5.48#39.46±4.65*44.92±6.15*&22.251＜0.001 T（ng/mL 341.32±49.48 199.74±28.11*227.44±40.75*275.36±50.16*&25.593＜0.001

2.3 各组大鼠卵巢组织形态变化 假手术组镜下见不同发育期的黄体与卵泡，偶尔可以发现排卵期清晰的卵泡结构，卵泡壁时由多层的颗粒细胞构成，且排列整齐、形态比较完成，未见囊性卵泡，图1。PCOS 组镜下见卵泡囊性病变，窦腔扩大，卵泡中无卵母细胞与放射冠，颗粒细胞层数下降，无成熟卵泡、黄体与排卵现象，图2。洋甘菊提取物高剂量组镜下可见成熟卵泡与黄体，数量略少于假手术组；部分卵泡结构清晰，颗粒细胞形态完整，排列整齐，无囊性卵泡，图3。

图1 假手术组卵巢组织形态

图2 PCOS组卵巢组织形态

图3 洋甘菊提取物高剂量组大鼠卵巢组织形态

2.4 各组大鼠子宫容受性指标比较 与假手术组比较，PCOS 组LIF、整合素β3 蛋白的OD 值显著下降，差异有统计学意义（F分别为46.472、79.650，P＜0.05）；与PCOS 比较，洋甘菊提取物低剂量与高剂量组LIF、整合素β3蛋白的OD值上升，且高剂量组OD值更高，差异有统计学意义（P＜0.05），表3。

表3 各组大鼠子宫容受性指标的OD值比较（±s）

表3 各组大鼠子宫容受性指标的OD值比较（±s）

与假手术组比较，#P＜0.05；与PCOS组比较，*P＜0.05；与洋甘菊的提取物低剂量组比较，&P＜0.05

组别假手术组PCOS组洋甘菊提取物低剂量组洋甘菊提取物高剂量组F P例数10 15 15 15 LIF蛋白0.42±0.09 0.16±0.04#0.36±0.05#0.40±0.08#*46.472＜0.001整合素β3蛋白0.39±0.07 0.14±0.03#0.37±0.05#0.43±0.07#*79.650＜0.001

2.5 各组大鼠卵巢组织PI3K、AKT 蛋白表达 与假手术组比较，PCOS 组卵巢组织PI3K、AKT 蛋白表达下调，差异有统计学意义（F分别为100.311、46.663，P＜0.05）；与PCOS 比较，洋甘菊提取物低剂量与高剂量组PI3K、AKT 蛋白表达上调，且高剂量组PI3K、AKT 蛋白上调高于低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05），图4。

图4 各组大鼠卵巢组织PI3K、AKT蛋白表达图

2.6 各组大鼠卵巢组织PI3K、AKT mRNA 表达与假手术组比较，PCOS 组卵巢组织PI3K、AKT mRNA 降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与PCOS比较，洋甘菊提取物低剂量与高剂量组PI3K、AKT mRNA 上升，且高剂量组PI3K、AKT mRNA 高于低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05），表4。

表4 各组大鼠卵巢组织PI3K、AKT mRNA表达（±s）

表4 各组大鼠卵巢组织PI3K、AKT mRNA表达（±s）

与假手术组比较，#P＜0.05；与PCOS组比较，*P＜0.05；与洋甘菊的提取物低剂量组比较，&P＜0.05

组别假手术组PCOS组洋甘菊提取物低剂量组洋甘菊提取物高剂量组F P例数10 15 15 15 PI3K mRNA 1.03±0.15 0.26±0.09#0.84±0.12*0.96±0.16*&100.311＜0.001 AKT mRNA 0.98±0.21 0.31±0.08#0.75±0.17*1.12±0.28*&46.663＜0.001

3 讨论

PCOS 不仅对患者生殖功能有影响，还因异常代写导致糖尿病、动脉硬化等并发症。因此，治疗PCOS 或PCOS 伴胰岛素抵抗需兼顾改善生殖功能与纠正代谢[9]。西医能够利用环丙孕酮等药物将患者的内源性雌激素进行调节，但该手段对子宫内膜的发育具有一定程度的影响，且降低患者的妊娠率。中医在治疗PCOS 方面具有一定的优势，中医讲究辨证论治、标本兼治理念。补肾药物可调节机体垂体的功能，改善PCOS 患者的卵巢症状[10-11]。洋甘菊是一类草木药物，其药理活性比较广泛，可对内分泌进行调节，同时可以调节子宫内膜氧化应激作用[12]。

PCOS 患者体内的激素水平出现紊乱，其雄激素过高表达，相对健康人群FSH 水平较低，FSN 的分泌能加速卵泡的成熟，且水平会跟随经期变化而产生变化，FSH 的水平可间接呈现出患者的卵巢功能，对PCOS 诊断具有很强的临床意义[12]。LH 稳定表达于健康机体，PCOS 体内含量上升，该结果与PCOS 胰岛素抵抗障碍有关。胰岛素能上调LH，刺激雄激素而增加其合成，提高睾酮水平[13]。E2在健康女性体内水平较为稳定，PCOS 患者中E2 水平较低[14]。中医治疗从痰湿、瘀血等方面着手[15]。洋甘菊为菊科植物，具有降血压及胆固醇、通便发汗等功效[16]。研究显示，洋甘菊提取物有降糖效果，且能改善小鼠糖耐量，能治疗糖尿病[17]。多数PCOS 患者存在不同程度胰岛素抵抗，且患者并发2 型糖尿病风险增加。洋甘菊提取物中含有黄酮，该物质能降糖、抑制葡萄糖代谢酶活性、改善胰岛素抵抗及抗氧化损伤等[18]。本研究中洋甘菊提取物低剂量与高剂量组大鼠子宫指数相对于PCOS 组有所下降，差异有统计学意义（P＜0.05），结合激素水平调节，说明洋甘菊提取物能改善患者生殖功能。子宫的容受性功能相关指标主要由整合素β3 与LIF，研究发现，不孕不育女性，子宫内膜的整合素β3 与LIF 表达下降甚至不表达，上调其表达水平后可以明显的改善子宫内膜的容受性。LIF能够提高整合素β3的表达，提高子宫内膜与胚泡的黏附性，增加患者的妊娠率。PCOS 患者体内的整合素β3 表达存在异常，可造成子宫内膜容受性出现缺陷，导致不孕症。洋甘菊提取物能改善PCOS大鼠的血清激素代谢情况，提高雌性大鼠的妊娠率，调节整合素β 3和LIF子宫容受性相关指标水平。

PI3K/AKT 的信号通路为重要调节因子，与PCOS 发生发展密切相关[19]。PCOS 患者体内的胰岛素分泌增加，可改变MAPK 表达从而激活转录因子，进而调节细胞的周期蛋白活性。AKT 是PI3K的下游相关靶蛋白，在PCOS 中磷酸化的PI3K，可以调节GSK-3β 抑制糖原合成。PIEN 为PI3K 信号负调控因子，可确保卵巢排卵并对PI3K 表达具有促进作用。刘敏[20]研究中建立PCOS 大鼠的模型，发现过表达miR-320UI 能够保护卵巢，作用机理和PI3K/AKT相关信号通路激活有关。

综上所述，洋甘菊提取物能上调PCOS 大鼠血清雌激素水平，提高子宫容受性，且稳定雌激素水平，其病情改善呈现浓度依懒性，其作用机制可能与PI3K/AKT通路有关。