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基于PI3K/AKT通路探讨洋甘菊提取物改善PCOS大鼠生殖功能的研究

2022-07-12樊荣华

转化医学杂志 2022年3期
关键词:洋甘菊整合素卵泡

杜 丹,樊荣华

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)影响育龄妇女生殖功能,目前尚不明确其发病原因与机制。该病主要的特点是高雄激素血症,患者可表现为不出现闭经情况但排卵已经停止,是育龄期的女性不孕原因之一[1-2]。PCOS患者子宫内膜变薄,其容受性与内膜血流量下降,尚未明确机制。磷酸酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 通路(phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B,PI3K/AKT)为常见通路,其中PI3K 为异源二聚体,雌激素结合细胞需激活PI3K,有助于AKT 表达;AKT 活化后可扩张血管。PI3K/AKT 活化可提高子宫内膜生长,促进胚胎分化[3-4]。中医将PCOS 归属于“月经不调、不孕症”范畴,肾虚为本、痰湿血瘀为标。对于该类型妇科疾病,以补肾中药材为最佳[5]。洋甘菊为东欧与南欧地区常见药物植物,主要活性成分有酚类、类黄酮、植物雌激素[6]。洋甘菊提取物具有抗炎、抗氧化、抗病毒、保护血管等作用[7]。本研究通过建立PCOS大鼠模型以观察其高低浓度的洋甘菊提取物对大鼠生殖功能、PI3K/AKT 蛋白表达的机制进行分析,报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 55 只成年雌性大鼠购于四川省医学科学院实验动物中心,SPF 级,合格证号SCXK(川)2020-24,体质量100~200 g,鼠龄8~10 周。适应性饲养2 周后开始实验。本实验经宜宾市第三人民医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及分组 参照[8]方法造模,对大鼠皮下注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,HCG)(购自丽珠制药厂)30 U,每日1次,持续注射22 d;同时每日注射1 次胰岛素(购自武汉优尔生科技有限公司),前11 d皮下注射0.5 U,后逐渐增加剂量至6 U,维持注射至第22 天。大鼠每日注射药物后检查阴道涂片,连续观察20 d,当大鼠动情周期完全无变化则表示造模成功[8]。取10 只大鼠作为假手术组,剩余大鼠按模型制备成功造模后分为PCOS 组、洋甘菊提取物低剂量组及高剂量组,各15 只。给药方式:造模后1 d 进行灌胃给药,假手术组(于造模期间为其注射生理盐水,持续注射22 d)与PCOS组以4 mL/kg标准给予生理盐水;低剂量组以45 mg/mL 标准给予洋甘菊提取物(购自南京道斯夫生物科技有限公司),高剂量组以75 mg/kg 标准灌胃,两组给药体积均为4 mL/kg;每日1 次,持续给药30 d。洋甘菊提取物浓度高低参考文献[6]确定。取材:最后1 次给药2 h 后麻醉处理;称重,于腹主动脉部位取血置于离心管内,离心后取血清,冷冻保存。摘除大鼠子宫称重,并放于多聚甲醛中固定;子宫指数=子宫重量/体质量。

1.2.2 血清样本检测 取冷冻保存的血清溶解,放射免疫分析法检测血清的促卵泡生成激素(follicle stimulating hormone,FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、孕酮(progesterone,P)、雌二醇(estradiol,E2)、睾酮(testosterone,T)含量。

1.2.3 苏木精-伊红( hematoxylin-eosin,HE )染色 取子宫组织固定于多聚甲醛溶液内,脱水,在二甲苯中透明,制切片;切片用苏木素染色15 min后使用磷酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)清洗3 次;伊红染色后PBS清洗透明,镜下观察病理变化。

1.2.4 卵巢组织观察 取大鼠卵巢部位的组织,通过甲醛实施固定,再通过石蜡包埋、HE给予染色后放置在光学显微镜下进行病理形态观察。

1.2.5 免疫组化检测 免疫组化检测子宫容受性指标白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)与整合素β3:雌激素检测后各组选取5 只大鼠,当日下午将大鼠放入笼内,各个笼里放雄性大鼠2 只,第2 天观测雌性大鼠的阴道情况,其中若发现了数量众多的精虫则确定妊娠首日,5 d 后处死雌鼠取其子宫,甲醛固定水化,静置30 min后加1%乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA),用山羊血清封闭;加抗LIF、整合素β3抗体,再加入二抗,复染封皮;于显微镜下选无交叉的5 个视野计算其光密度值(optical density,OD值)。

1.2.6 免疫印迹法检测 免疫印迹法对AKT、PI3K蛋白的表达情况进行检测:在子宫的组织内加适量的胰蛋白裂解液,通过离心处理,之后取上层液体加入样孔内;接下来经过电泳、转膜、浸泡TRIS 缓冲盐溶液(TRIS buffered saline solution,TBS),反复采用PBS给予冲洗,分别向聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上滴加一抗兔抗鼠PI3K、AKT(1:500),二抗(1:1 000),杂交后再次冲洗3次,放入ECL工作液内检测,获取图像。

1.2.7 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测 PCR 方式对组织中的AKT 、PI3K mRNA 表达进行检测:采用适量的胰蛋白酶消化大鼠的子宫组织,之后在低温条件下将其研磨成浆,将RNA 提取后用乙醇离心处理,冷冻保存;反应条件为:于98 ℃进行6 min;再于98 ℃下28 s,75 ℃下30 s,80 ℃下4 min,共55个循环。

1.3 统计学处理 应用SPSS20.0 软件,符合正态分布的计量资料以均数±标准差()表示,组间行t检验;多组间采用单因素方差分析;P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量与子宫指数比较 与假手术组比较,PCOS组体质量与子宫指数显著上升,差异有统计学意义(F=39.410,P<0.05);与PCOS 组比较,洋甘菊提取物低剂量与高剂量组大鼠体质量与子宫指数显著下降,且高剂量组比低剂量组更低,差异有统计学意义(F=149.772,P<0.05),表1。

表1 各组大鼠体征与子宫指数比较(±s)

表1 各组大鼠体征与子宫指数比较(±s)

与假手术组比较,#P<0.05;与PCOS组比较,*P<0.05;与洋甘菊的提取物低剂量组比较,&P<0.05

组别假手术组PCOS组洋甘菊提取物低剂量组洋甘菊提取物高剂量组F P例数10 15 15 15体质量(g)197.32±10.21 235.64±11.15#223.46±10.17*203.64±9.31*&39.410<0.001子宫指数(mg/g)1.02±0.05 2.54±0.16#1.95±0.17*1.12±0.34*&149.772<0.001

2.2 各组大鼠激素水平比较 与假手术组比较,PCOS 组LH 水平显著上升,FSH、E2、P、T 水平下降,差异有统计学意义(F分别为32.331、27.140、16.732、22.251、25.593,P<0.05);与PCOS 比较,洋甘菊提取物低剂量与高剂量组LH 水平下降,FSH、E2、P、T 水平上升,且高剂量组激素水平改善更佳,差异有统计学意义(P<0.05),表2。

表2 各组大鼠性激素水平比较(±s)

表2 各组大鼠性激素水平比较(±s)

与假手术组比较,#P<0.05;与PCOS组比较,*P<0.05;与洋甘菊的提取物低剂量组比较,&P<0.05

组别假手术组PCOS组洋甘菊提取物低剂量组洋甘菊提取物高剂量组F P例数10 15 15 15 LH(U/L)6.01±1.51 12.91±2.83#8.12±1.87*7.25±1.04*&32.331<0.001 FSH(mU/mL)1.46±0.23 0.88±0.16#1.10±0.21*1.39±0.16*&27.140<0.001 E 2(ng/L)31.16±5.67 18.82±3.54#25.56±4.02*26.39±4.71*&16.732<0.001 P(μg/L)51.32±8.56 32.16±5.48#39.46±4.65*44.92±6.15*&22.251<0.001 T(ng/mL 341.32±49.48 199.74±28.11*227.44±40.75*275.36±50.16*&25.593<0.001

2.3 各组大鼠卵巢组织形态变化 假手术组镜下见不同发育期的黄体与卵泡,偶尔可以发现排卵期清晰的卵泡结构,卵泡壁时由多层的颗粒细胞构成,且排列整齐、形态比较完成,未见囊性卵泡,图1。PCOS 组镜下见卵泡囊性病变,窦腔扩大,卵泡中无卵母细胞与放射冠,颗粒细胞层数下降,无成熟卵泡、黄体与排卵现象,图2。洋甘菊提取物高剂量组镜下可见成熟卵泡与黄体,数量略少于假手术组;部分卵泡结构清晰,颗粒细胞形态完整,排列整齐,无囊性卵泡,图3。

图1 假手术组卵巢组织形态

图2 PCOS组卵巢组织形态

图3 洋甘菊提取物高剂量组大鼠卵巢组织形态

2.4 各组大鼠子宫容受性指标比较 与假手术组比较,PCOS 组LIF、整合素β3 蛋白的OD 值显著下降,差异有统计学意义(F分别为46.472、79.650,P<0.05);与PCOS 比较,洋甘菊提取物低剂量与高剂量组LIF、整合素β3蛋白的OD值上升,且高剂量组OD值更高,差异有统计学意义(P<0.05),表3。

表3 各组大鼠子宫容受性指标的OD值比较(±s)

表3 各组大鼠子宫容受性指标的OD值比较(±s)

与假手术组比较,#P<0.05;与PCOS组比较,*P<0.05;与洋甘菊的提取物低剂量组比较,&P<0.05

组别假手术组PCOS组洋甘菊提取物低剂量组洋甘菊提取物高剂量组F P例数10 15 15 15 LIF蛋白0.42±0.09 0.16±0.04#0.36±0.05#0.40±0.08#*46.472<0.001整合素β3蛋白0.39±0.07 0.14±0.03#0.37±0.05#0.43±0.07#*79.650<0.001

2.5 各组大鼠卵巢组织PI3K、AKT 蛋白表达 与假手术组比较,PCOS 组卵巢组织PI3K、AKT 蛋白表达下调,差异有统计学意义(F分别为100.311、46.663,P<0.05);与PCOS 比较,洋甘菊提取物低剂量与高剂量组PI3K、AKT 蛋白表达上调,且高剂量组PI3K、AKT 蛋白上调高于低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05),图4。

图4 各组大鼠卵巢组织PI3K、AKT蛋白表达图

2.6 各组大鼠卵巢组织PI3K、AKT mRNA 表达与假手术组比较,PCOS 组卵巢组织PI3K、AKT mRNA 降低,差异有统计学意义(P<0.05);与PCOS比较,洋甘菊提取物低剂量与高剂量组PI3K、AKT mRNA 上升,且高剂量组PI3K、AKT mRNA 高于低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05),表4。

表4 各组大鼠卵巢组织PI3K、AKT mRNA表达(±s)

表4 各组大鼠卵巢组织PI3K、AKT mRNA表达(±s)

与假手术组比较,#P<0.05;与PCOS组比较,*P<0.05;与洋甘菊的提取物低剂量组比较,&P<0.05

组别假手术组PCOS组洋甘菊提取物低剂量组洋甘菊提取物高剂量组F P例数10 15 15 15 PI3K mRNA 1.03±0.15 0.26±0.09#0.84±0.12*0.96±0.16*&100.311<0.001 AKT mRNA 0.98±0.21 0.31±0.08#0.75±0.17*1.12±0.28*&46.663<0.001

3 讨论

PCOS 不仅对患者生殖功能有影响,还因异常代写导致糖尿病、动脉硬化等并发症。因此,治疗PCOS 或PCOS 伴胰岛素抵抗需兼顾改善生殖功能与纠正代谢[9]。西医能够利用环丙孕酮等药物将患者的内源性雌激素进行调节,但该手段对子宫内膜的发育具有一定程度的影响,且降低患者的妊娠率。中医在治疗PCOS 方面具有一定的优势,中医讲究辨证论治、标本兼治理念。补肾药物可调节机体垂体的功能,改善PCOS 患者的卵巢症状[10-11]。洋甘菊是一类草木药物,其药理活性比较广泛,可对内分泌进行调节,同时可以调节子宫内膜氧化应激作用[12]。

PCOS 患者体内的激素水平出现紊乱,其雄激素过高表达,相对健康人群FSH 水平较低,FSN 的分泌能加速卵泡的成熟,且水平会跟随经期变化而产生变化,FSH 的水平可间接呈现出患者的卵巢功能,对PCOS 诊断具有很强的临床意义[12]。LH 稳定表达于健康机体,PCOS 体内含量上升,该结果与PCOS 胰岛素抵抗障碍有关。胰岛素能上调LH,刺激雄激素而增加其合成,提高睾酮水平[13]。E2在健康女性体内水平较为稳定,PCOS 患者中E2 水平较低[14]。中医治疗从痰湿、瘀血等方面着手[15]。洋甘菊为菊科植物,具有降血压及胆固醇、通便发汗等功效[16]。研究显示,洋甘菊提取物有降糖效果,且能改善小鼠糖耐量,能治疗糖尿病[17]。多数PCOS 患者存在不同程度胰岛素抵抗,且患者并发2 型糖尿病风险增加。洋甘菊提取物中含有黄酮,该物质能降糖、抑制葡萄糖代谢酶活性、改善胰岛素抵抗及抗氧化损伤等[18]。本研究中洋甘菊提取物低剂量与高剂量组大鼠子宫指数相对于PCOS 组有所下降,差异有统计学意义(P<0.05),结合激素水平调节,说明洋甘菊提取物能改善患者生殖功能。子宫的容受性功能相关指标主要由整合素β3 与LIF,研究发现,不孕不育女性,子宫内膜的整合素β3 与LIF 表达下降甚至不表达,上调其表达水平后可以明显的改善子宫内膜的容受性。LIF能够提高整合素β3的表达,提高子宫内膜与胚泡的黏附性,增加患者的妊娠率。PCOS 患者体内的整合素β3 表达存在异常,可造成子宫内膜容受性出现缺陷,导致不孕症。洋甘菊提取物能改善PCOS大鼠的血清激素代谢情况,提高雌性大鼠的妊娠率,调节整合素β 3和LIF子宫容受性相关指标水平。

PI3K/AKT 的信号通路为重要调节因子,与PCOS 发生发展密切相关[19]。PCOS 患者体内的胰岛素分泌增加,可改变MAPK 表达从而激活转录因子,进而调节细胞的周期蛋白活性。AKT 是PI3K的下游相关靶蛋白,在PCOS 中磷酸化的PI3K,可以调节GSK-3β 抑制糖原合成。PIEN 为PI3K 信号负调控因子,可确保卵巢排卵并对PI3K 表达具有促进作用。刘敏[20]研究中建立PCOS 大鼠的模型,发现过表达miR-320UI 能够保护卵巢,作用机理和PI3K/AKT相关信号通路激活有关。

综上所述,洋甘菊提取物能上调PCOS 大鼠血清雌激素水平,提高子宫容受性,且稳定雌激素水平,其病情改善呈现浓度依懒性,其作用机制可能与PI3K/AKT通路有关。

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