卵泡的生长发育及其腔前卵泡体外培养研究进展

何 宇

（渭南职业技术学院护理系，陕西 渭南714000）

哺乳动物卵巢含有大量处于不同发育阶段的卵母细胞,其中多数卵母细胞存在于无腔阶段的卵泡中，但大部分卵泡在无腔阶段（腔前卵泡）中闭锁、退化，没有得到相应的利用,这无疑是动物遗传和育种资源的极大浪费。因此，腔前卵泡的开发无疑是解决这一难题的有效途径。腔前卵泡的体外培养技术已取得了一定的发展，建立了多种培养体系,有其各自的优缺点,本文就动物卵泡的生长发育及其腔前卵泡的体外培养研究方面做一综述。

1 卵泡生长发育的一般规律和动态模式

卵泡发育始于胎儿期。胎儿出生时卵巢中已经存在不同早期发育阶段的卵泡，动物进入性成熟期不断会有成批卵泡及时成长，其中一个或数个成熟和排放，同时也会不断有卵泡凋亡。动物一旦进入老龄期，随着卵巢机能的退化不再有卵泡发育。卵泡形成后，部分原始卵泡脱离原始卵泡库，开始缓慢生长。此即所谓的原始卵泡启动募集。在原始卵泡启动以后，卵母细胞周围的一层原始颗粒细胞其形态由扁平状的转变成立方或柱状。随着卵泡的进一步发育，卵母细胞增大，颗粒细胞增多并由单层成多层，在第二层颗粒细胞出现时，透明带开始形成，并伴有卵泡膜细胞的形成，此时的卵泡称为次级卵泡。次级卵泡进一步发育成为三级卵泡。在这个时期，卵泡细胞分泌的液体进入卵泡细胞和卵母细胞间隙，形成卵泡腔。卵泡腔内的液体为卵泡液，随着卵泡液分泌量的增多，卵泡腔进一步扩大，卵母细胞被挤到一边，并被包围在一团颗粒细胞中，形成突于卵泡腔中的半岛，称为卵丘。其余的颗粒细胞则紧贴在卵泡腔周围，形成卵泡壁层的颗粒细胞层。卵泡发育到最大体积时，卵泡壁变薄，卵泡腔内的卵泡液体积增加到最大，称为成熟卵泡。哺乳动物性成熟后，只有少数的原始卵泡生长发育成熟并排卵，绝大多数卵泡中途闭锁而死亡,少数卵泡发育成熟至排卵[1]。

卵泡发育从形态上可分为几个阶段,依次为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡、格拉夫卵泡和排卵前的成熟卵泡。有的把初级卵泡开始生长以至三级卵泡阶段,统称为生长卵泡。有的又根据卵泡出现泡腔与否分为腔前卵泡(或称无腔卵泡)和有腔卵泡(或称囊状卵泡)。三级卵泡以前的卵泡尚未出现卵泡腔统称为腔前卵泡。三级卵泡开始出现泡腔后至成熟卵泡,称为有腔卵泡[2]。

卵泡的生长发育是一个动态的过程，开始于募集一个或多个原始卵泡到生长卵泡库，终止于排卵或卵泡闭锁，呈现“卵泡波”的特征。卵泡波实质上就是卵泡周期性生长发育的一种动态变化过程。首先，卵泡库中一组卵泡被吸收发育，其中有一个或数个确立为优势化卵泡继续生长发育，并明显抑制其余卵泡的生长，最终导致它们闭锁。在正常发情周期中一个卵子排出大概经历下列过程：吸收，选择，优势化，退化或排卵[3]。

2 动物腔前卵泡体外培养的研究概况

动物腔前卵泡的研究开始于20世纪60年代。当时的研究仅限于细胞分离的方法和卵巢形态学与组织学等方面的内容。Gorb[4]等用0.5%链酶蛋白酶消化小鼠卵巢中的纤维组织，分离腔前卵泡，得到了初级卵泡、生长卵泡及排卵前卵泡，并研究了卵泡在体内的生长和内分泌的活动。随后，Niocsia等[5]比较系统地建立了一套家兔各级卵泡的分离技术。20世纪80年代，Roy等[6]分离仓鼠卵巢卵泡取得成功，部分已形成腔。Lisa建立了大鼠腔前卵泡新的培养体系,即多聚赖氨酸铺层体外培养大腔前卵泡,在体外观察到了卵泡内膜的形成过程和卵泡腔的形成[7]。人的腔前卵泡研究比较晚，这是由于人卵巢组织的来源十分有限，加之一些社会因素，阻碍了人腔前卵泡的研究。Roy等[8]年首次报道了人腔前卵泡的分离和培养。Dolmans等[9]等改用纯净的胶原酶获得数量少但是质量好的人腔前卵泡。目前,啮齿类动物已从何原始卵泡培养到排卵、受精最终获得了活的小鼠[10]。家畜类腔前卵泡的研究进展也很大，取得突破性进展的是Figueiredo等[11]建立了一套酶结合机械法成功的回收了大量牛的各级卵泡。Hirao等[12]先用酶法处理，再用机械法剥离猪卵巢卵泡，经体外培养获得成熟卵子，受精后实现精子穿入。Gpuat等[13]用机械方式分离水牛的小腔前卵泡，与牛卵巢间质细胞或胎牛成纤维细胞共同培养可以存活30d。在国外，猪腔前卵泡实现在体外培养、生长发育并获得受精的能力。国内其卵裂率达到60%,囊胚率为22%[14]。在牛上，腔前卵泡在无血清的培养系统中可以存活28d，并形成卵泡腔，成腔率达50%[15-16]。芮荣等[17]体外培养山羊腔前卵泡16d，获得了1枚孤雌激活卵。且EGF(50ng/ml)与IGF-I(100ng/ml)的联合培养能够提高山羊腔前卵泡卵母细胞的生长率和成活率[18]。

［1］谢成侠,等.家畜繁殖及其应用[M].南京:江苏科学技术出版社,1993:25.

［2］杨增明.生殖生物学[M].北京:科学出版社,2005:75-83.

［3］吴延光,于元松,谭景和.哺乳动物卵泡发育模式及调控机理[J].动物学杂志,2002(37):83-87.

［4］Grob HS.Enzymatic dissection of the mammalian ovary[J].Science，1964,146:73-74.

［5］Nicosia SV，Evangelista I，Batta SK.Rabbit ovarian follicles.Isolation technique and characterization at different stages of development[J].Biol Reprod，1975,13:423-447.

［6］Roy SK，Greenwal GS.An enzymatic method for dissociation of intact follicles from the hamster ovary:histological and quatitative aspects[J].Biol Reprod，1985,32:203-215.

［7］Lisca,Shilla C,Thoma S J C.In vitro folliculogenesis of rat preantral follicles[J].Endocrinology,1995,136:3369-3371.

［8］Roy SK，Treacy BJ.Isolation and long-term culure of human preantral follicles[J].Fertil Steril,1993,59:783-790.

［9］Dolmans MM,Michaux N,Camboni A，et al.Evaluation of Liberase,a purified enzyme blend,for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles[J].Human Reproduction,2006,12(2):413-420.

［10］Eppig J J，O’Brien M J.Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles[J].Biol ReProd，1996,54:197-207.

［11］Figueiredo J R，Hulshof S C J，Vanden Hurk R，et al.Develoment of a combined new mechanical and enzymatie method for the isolation of intact preantral follicles from fetal，calf and adult bovine ovaries[J].Theriogenology，1993,40:789-799.

［12］Hirao Y，Nagai T，Kubo M，et al.In vitro growth and maturation of pig oocytes[J].Jomal of Reproduetion and Fertility，1994，100:333-339.

［13］Gupta P S，Nandi S，Revindranatha B M,et al.In vitro culture of buffalo(Bubalus bubalis)Preantral follieles[J].Theriogenology，2002，57(7):1839-1854.

［14］Wu J,Qi T.Role of follicle stimulating hormone and epidermal growth factor in the development of porcine preant ral follicle in vitro[J].Zygote,2007,15:233-240.

［15］McCaffery F H，Leask R，Riley SC，et al.Culture of bovine preantral follicles in a serum-free system:markers for assessment of growth and development[J].Biology of Reproduction，2000，63:267-273.

［16］周虚,RobertWebb.牛腔前卵泡在体外无血清培养中发育为有腔卵泡[J].中国兽医学报,2002,22(5):518-519.

［17］芮荣,张涌.山羊腔前卵泡卵母细胞体外发育与体外成熟的研究[J].畜牧兽医学报,2000,31(6):481-491.

［18］Huanmin Zhou,Yong Zhang.Regulation of in vitro growth of preantral follicles by growth factors in goats[J].Domestic Animal Endocrinology,2005,28:235-242.