去泛素化酶OTUB1参与细胞铜缺乏的应答

张宇飞，朱基彦，瞿思遥，张祝琴，刘德培

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室生物化学与分子生物学系，北京 100005)

心血管疾病是一类常见的疾病，其发病在全球范围内呈上升趋势，是造成残疾和死亡的主要原因之一[1]。临床和实验证据表明，缺血性心脏病和心肌肥厚过程中铜含量降低， 铜耗尽参与了缺血性心脏病和心肌肥厚的发病进程[2-3]。在临床上，铜缺乏也是心血管疾病发生的诱因之一。铜元素是动物生长发育必需的微量营养素，它可以作为机体代谢所需的多种关键酶的辅助因子[4]。体内的铜代谢受到多种铜转运相关蛋白的严密调控，其中铜转运蛋白1(copper transporter 1，CTR1)负责将铜从细胞外运送至细胞内[5]。日常铜摄入不足或铜代谢相关基因如Ctr1的突变或缺失均会导致铜的缺乏。目前已有报道，心脏特异性敲除Ctr1的小鼠心脏中铜含量降低，导致了心肌肥厚的发生，但分子机制尚未阐明[6]。因此，本文构建了Ctr1敲除的H9c2细胞株，探究是否存在铜依赖的酶参与细胞铜缺乏的应答，从而参与铜缺乏引起的心肌肥厚的发生。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞:原代大鼠心肌细胞系H9c2购自中国医学科学院基础医学研究所国家实验细胞资源共享平台。

1.1.2 实验材料:DMEM高糖培养基，PBS(赛维尔生物科技公司)；0.25%胰蛋白酶(北京雷根生物技术公司)；胎牛血清(GE Healthcare公司)；青霉素-链霉素-两性霉素(北京索莱宝科技公司)；多元素标准溶液(国家有色金属及电子分析测试中心)；RNA提取试剂盒(上海奕杉生物科技公司)；反转录试剂盒(TaKaRa公司)；Taq Pro Universal SYBR(南京诺唯赞生物科技公司)；四硫钼酸盐(tetrathiomolybdate，TTM)、咪唑(Sigma-Aldrich公司)；Lipo3000转染试剂，BCA检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)；PVDF膜、Ni NTA Binding Resin(Millipore公司)；β-actin抗体、GAPDH抗体(Abclonal公司)；CTR1抗体(Proteintech公司)；OTUB1抗体(Abcam公司)；Ubiquitin抗体(Santa Cruz公司)；K48 linkage ubiquitin抗体、K63 linkage ubiquitin抗体、mTOR抗体，p-mTOR抗体、p70S6K抗体和p-p70S6K抗体(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1Ctr1-/-的H9c2细胞株构建:H9c2细胞培养于含三抗和10% FBS的DMEM培养基中，置于37 ℃恒温、5% CO2的细胞培养箱内。细胞操作的全过程在超净工作台中进行。使用Lipo3000转染试剂将Ctr1敲除载体转染入细胞中，经流式细胞测量术筛选获得单克隆细胞。待细胞数量扩增至105数量级，提取基因组DNA，对切割位点处进行测序，筛选出Ctr1纯合敲除的H9c2细胞。sgRNA(small guide RNA)序列上游引物：5′-CACCGTGGTGATGTT GTCGTCCGTG-3′，下游引物5′-AAACCACGGACGAC AACATCACCAC-3′。

1.2.2 电感耦合等离子质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)检测细胞中铜含量:将细胞用0.25%胰蛋白酶充分消化下来，使用PBS清洗干净。重悬细胞后，进行细胞计数。之后放入离心机中，800 r/min离心5 min，吸出弃去上层液体。在细胞沉淀中，加入30～50 μL 65%浓硝酸。充分吹打混匀，使细胞充分溶解，直至无沉淀为止。根据细胞溶液体积加入去离子水，将硝酸浓度稀释至1%。将5%硝酸浓度的多元素标准溶液(Cu、Fe、Zn)稀释至1%，然后用1%稀硝酸配制梯度浓度的金属离子标准品。将样品置于ICP-MS中上机检测，根据标准品绘制标准曲线，最终计算出各样品中铜的含量。

1.2.3 实时定量PCR(qPCR)检测基因表达:弃去培养基，使用PBS充分清洗细胞。使用RNA提取试剂盒提取细胞中的RNA。测量RNA浓度。然后使用反转录试剂盒将2 μg RNA配制成20 μL体系， 置于PCR扩增仪反转录为cDNA。取1 μL cDNA模板，加入Taq Pro Universal SYBR酶、上下游引物和水配制为20 μL体系，置于荧光定量扩增仪中进行qPCR反应。根据2-△△Ct计算基因的差异表达倍数。引物序列如下：Gapdh上游引物5′-TGACA ACTCCCTCAAGAT TGTCA-3′，下游引物5′-GGCAT GGACTGTGGTCATGA-3′；Ctr1上游引物5′-CTTGC CCTGGGAAGACCTTT-3′，下游引物5′-TTGTCGTCCG TGTGGTTCAT-3′。

1.2.4 Western blot检测蛋白质表达水平:向RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，提取细胞总蛋白。提取后使用超声破碎仪处理样品2 min，置于低温离心机中，12 000 r/min离心2 min。收集上清蛋白质溶液。使用BCA试剂盒测量蛋白质浓度。向蛋白质中加入SDS上样缓冲液，沸水浴5 min。配制10%聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白质样品加入上样孔中，60 V电泳1 h，随后120 V电泳直至条带充分分开。使用湿转法，300 mA转膜1.5 h，将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜上。然后将膜置于含5%脱脂牛奶的TBST中封闭1 h。取出膜条，用TBST清洗3次，随后置于一抗中4 ℃孵育过夜。用TBST清洗膜条3次。在含5%脱脂牛奶的TBST中按1∶5 000稀释二抗，将膜条置于二抗中室温孵育1.5 h。用TBST充分清洗，加入ECL发光显色液，成像拍照。

1.2.5 铜亲和树脂蛋白质结合实验:配制结合液(含20 mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液)、清洗液(含100 mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液)和洗脱液(含50 mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲液)。将Ni NTA亲和树脂从保存液中吸出，2 000 r/min离心3 min后，弃上清，加入结合液置于风车上旋转清洗，每次5 min。离心弃上清，用洗脱液清洗树脂两次，每次5 min。用洗脱液清洗树脂过夜。用结合液洗树脂3次，每次5 min。用ddH2O洗树脂3次，每次5 min，得到不含金属离子的空白树脂。取空白树脂用0.1 mol/L CuSO4溶液孵育1 h，使树脂与铜充分结合。用ddH2O洗树脂3次。将100 μL树脂(其中树脂约50 μL)从保存液中吸出，每管用1 mL ddH2O洗树脂1次，清洗5 min。用1 mL 结合液洗树脂3次，每次5 min。取WT、Ctr1-/-和2.5 μmol/L TTM处理48 h的3组H9c2细胞，用非变性的方法提取细胞蛋白。蛋白质提取后，放入超声破碎仪中适当超声。将蛋白质放入冷冻离心机中12 000 r/min离心2 min，取上清于新管。使用BCA试剂盒检测蛋白质浓度，取蛋白质总量为500 μg的蛋白质溶液，分别与含铜和不含铜的树脂4 ℃孵育过夜。离心后，弃掉上层液体。每管用1 mL 清洗液洗3次，每次5 min。加入适量的结合液与SDS上样缓冲液，充分混匀，沸水浴10 min。4 ℃离心12 000 r/min 2 min，取上层蛋白质，弃去下方树脂。将蛋白质溶液送往华大基因公司进行质谱分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 成功构建Ctr1敲除的H9c2细胞株

使用CRISPR/Cas9技术靶向大鼠Ctr1的2号外显子，成功构建Ctr1敲除(Ctr1-/-)的H9c2细胞株，细胞中Ctr1表达水平降低(P<0.01)，CTR1蛋白表达水平降低，铜含量下降(P<0.05)(图1)。

A.schematic diagram of sgRNA design targeting Ctr1 gene in H9c2 cells; B.genome sequencing results of Ctr1 knockout H9c2 cell strain; C.relative expression level of Ctr1 gene in Ctr1-/- H9c2 n=3); D.protein expression level of CTR1 in Ctr1-/- H9c2 cells；E.copper level Ctr1-/- H9c2 cells n=3)，**P<0.01, *P<0.05 compared with WT(wildtype)

2.2 筛选出能与铜结合的去泛素化酶OTUB1

野生型(wildtype,WT)、Ctr1-/-以及铜螯合剂TTM处理的细胞总蛋白经铜亲和树脂pull down后共同富集到130个蛋白，富集到的蛋白基因功能与信号通路与泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)密切相关，去泛素化酶卵巢肿瘤(ovarian tumor,OTU)相关蛋白1(OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding proteins 1, OTUB1)可能是与铜结合的酶。Western blot实验证明，OTUB1能够与铜结合(图2)。

2.3 铜缺乏的细胞中泛素化水平升高

Ctr1-/-细胞中，K48多聚泛素化水平升高，K63多聚泛素化水平降低，总体泛素化水平升高。H9c2细胞经2.5 μmol/L TTM处理后，随着时间的推移，总体泛素化水平升高(图3)。

2.4 铜缺乏的细胞中OTUB1功能受到抑制

在Ctr1-/-细胞和经2.5 μmol/L TTM处理48 h的细胞中，与对照组相比，OTUB1的靶蛋白DEPTOR(一种mTOR抑制分子)蛋白水平下降，mTOR激活(图4)。

3 讨论

心肌肥厚的发病机制复杂。Ca2+传递异常、线粒体功能缺失、氧化应激、蛋白合成降解异常等病理刺激，均可以触发下游广泛的信号通路促进心脏重构和功能障碍，导致病理性心肌肥厚及心力衰竭的发生[7]。UPS是细胞内控制蛋白降解的重要途径。泛素是一个由76个氨基酸组成的蛋白，可被泛素激活酶E1激活，与泛素结合酶E2相连，随后被运送至泛素连接酶E3与靶蛋白结合，而去泛素化酶DUB则与E3相反，可去除靶蛋白上的泛素。最后多泛素化蛋白被募集到26S蛋白酶体，消耗能量进行泛素依赖性的蛋白水解，降解底物蛋白[8]。由于蛋白质降解的缺陷，错误折叠或受损的异常蛋白质在细胞中积累，正常蛋白质过度降解而失去功能，均可以成为心血管疾病的诱因[9]。有文献报道，小鼠体内，心脏缺乏去泛素化酶OTUB1发生心肌肥厚和心力衰竭，导致小鼠过早死亡[10]。其分子机制为，OTUB1的缺失促进了mTOR抑制性调节因子DEPTOR的降解，导致细胞中mTOR信号通路的激活[10-11]。

A.Venn diagram analysis of copper-binding proteins in three groups of cells (WT, Ctr1-/- and TTM); B.GO enrichment analysis of enriched copper-binding proteins; C.KEGG pathway analysis of enriched copper-binding proteins; D.a list of copper-binding proteins involved in UPS; E.copper-binding capacity of the deubiquitinase OTUB1

A.K48-linkage polyubiquitin levels in WT and Ctr1-/- H9c2 cells; B.K63-linkage polyubiquitin levels in WT and Ctr1-/- H9c2 cells; C.total ubiquitin levels in WT and Ctr1-/- H9c2 cells; D.ubiquitin levels over time after H9c2 cells were treated with 2.5 μmol/L TTM from 0 hour to 48 hours

图4 铜缺乏的细胞中OTUB1功能受到抑制Fig 4 OTUB1 function was inhibited in copper-deficient cells

以往对缺铜导致的心肌肥厚仅从线粒体功能缺失、Ca2+传递异常角度考虑[6]。本文构建了铜缺乏的H9c2细胞模型，并通过铜亲和树脂质谱联合鉴定出能够与铜结合的UPS系统中重要的酶OTUB1。在铜缺乏的细胞中，K48多聚泛素化水平和总泛素化水平升高，与文献报道的OTUB1特性一致[12-13]；类似地，在缺铜条件下，OTUB1蛋白表达水平无明显变化，然而其下游DEPTOR水平下降，mTOR信号通路被激活，证明缺铜条件下，OTUB1的活性降低。

本文首次证明，铜能够与去泛素化酶OTUB1结合并调节其活性，参与蛋白质降解途径的调控，这一结果揭示了铜在生命活动中扮演的新角色，使人们对铜的生物学功能有了更深入的理解；此外，本文发现OTUB1参与铜缺乏导致的心肌肥厚发生，为临床上治疗由铜缺乏如门克斯病(Menkes disease)导致的心血管疾病以及其他疾病提供了新的思路。不足的是，本文仅在细胞模型水平进行验证，且铜与OTUB1结合的具体机制尚未充分研究。研究小组未来将进一步在模型动物中验证该机制，并研究铜与OTUB1具体结合的位点。