SIRT5通过调控ALDH5A1的琥珀酰化促进人乳腺癌细胞的增殖

康有力，赵 丹，杜文静，李 莉

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室, 北京 100005)

SIRT5属于组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDACs)家族，是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的赖氨酸去酰化酶，同时具有去乙酰化酶、去琥珀酰化酶、去丙二酰化酶和去戊二酰化酶活性，在调节多种关键细胞代谢通路中发挥着重要作用[1-5]。SIRT5调控参与三羧酸循环、糖酵解、脂肪酸氧化和氨基酸分解代谢的多种代谢酶[6-8]。SIRT5与肿瘤发生有关，然而其中的确切机制尚不明确，因为SIRT5可能在不同环境中作为肿瘤启动子或肿瘤抑制子[9-10]。

醛脱氢酶5家族成员A1(aldehyde dehydrogenase 5 family member A1，ALDH5A1)编码琥珀酸半醛脱氢酶(succinate-semialdehyde dehydrogenase，SSDH)，是一种参与线粒体三羧酸循环代谢的酶，可以催化琥珀酸半醛的氧化。Meta分析表明ALDH5A1在胶质瘤、白血病、淋巴瘤和乳腺癌中表达较高[11-13]。然而，ALDH5A1是否参与肿瘤的发展仍不清楚。

本研究系统分析了SIRT5的表达及其在某些癌中的临床结果与患者生存数据集。同时采用蛋白质组学的方法，分析细胞中的SIRT5代谢靶点与通路，发现并确认ALDH5A1是SIRT5的作用底物。分子与细胞实验结果显示SIRT5通过介导ALDH5A1的赖氨酸琥珀酰化促进乳腺癌细胞增殖。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人胚肾细胞系HEK-293T、人乳腺癌细胞系MCF7(ATCC细胞库)。

1.1.2 主要试剂：使用抗体如下：β-actin(Proteintech公司)； ALDH5A1(Santa公司)；HA-Tag、DYKDDDDK Tag、SIRT5(CST公司)。结晶紫(北京普利莱基因技术有限公司)；小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)(上海吉玛制药技术有限公司) ：ALDH5A1#1:5′-GCUGUGGGUUGAUUCCACATT-3′；ALDH5A1#2:5′-GCAUCUUAUCCGAGUGGAATT-3′；包含人源SIRT5、SIRT5H158Y和ALDH5A1片段的Flag及HA标签质粒(清华大学江鹏教授馈赠)；DMEM培养基(北京细工生物科技有限公司)；Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 SIRT5在泛癌中基因组的改变：使用cBioPortal(http://cbioportal.org)分析TCGA的多维癌基因组数据中SIRT5的基因组水平的改变，图中红色代表基因扩增，绿色代表基因突变，蓝色代表基因缺失，紫色代表同时具有多种改变。

1.2.2 SIRT5的差异表达分析：TNMplot数据库(https://www.tnmplot.com/)包含来自GEO、GTEx、TCGA和TARGET数据库的56 938个独特的多级质量控制样本，包括正常组织、肿瘤组织和转移性组织。使用TNMplot数据库可以比较正常和肿瘤组织中的基因表达。GEPIA数据库(http://gepia. cancer-pku.cn/)提供了一个可以研究正常和癌样本的RNA表达的平台，该数据库来自TCGA和GTEx项目[14]。本研究利用GEPIA对不同癌的肿瘤组织和正常组织中的SIRT5进行差异表达分析。

1.2.3 SIRT5在癌患者中的预后分析: 使用the Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis)绘制SIRT5在不同肿瘤中的生存曲线。为了分析患者的总生存期(overall survival,OS)，根据SIRT5的中位表达(高与低)将样本分为两组，计算具有95%置信区间(CIs)的危险比(HR)和log-rankP值，并在图中显示。PrognoScan(http://dna00.bio.kyutech.ac. jp/ PrognoScan/ index.html)整合了大量带有预后信息的芯片数据集，站内基本上包括了大部分的肿瘤数据[15]。本文绘制由最佳分割点二分的高(红色)和低(蓝色)表达组的生存曲线，每组的95%置信区间用虚线表示。

1.2.4 功能富集和通路分析：Metascape (http://metascape.org/gp/index.html)整合了GO、KEGG、UniProt、DrugBank等多个权威数据库资源，可以进行通路富集和生理过程注释，为每个基因提供全面详细的信息。对蛋白质组学分析出的基因进行GO富集和KEGG通路分析，P值<0.01，最小计数为3且富集系数>1.5时被认为是显著的。

1.2.5 细胞的培养与转染：所有细胞均使用DMEM培养基在5% CO2的培养箱中37 ℃培养。使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂按照说明书转染siRNA到细胞中。为了获得稳定的细胞株，将pCDH质粒与VSVG(疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G)和psPAX2包装质粒共转染HEK-293T细胞。转染后72 h从HEK-293T细胞培养皿中收集慢病毒上清，与8 μg/mL polybrene混合后加入目的细胞培养基中，24 h后换液。用2 μg/mL 嘌呤霉素筛选感染细胞1周。

1.2.6 免疫沉淀与免疫印迹检测：将收集的细胞用NP-40缓冲液[50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，0.1% NP-40和蛋白酶抑制剂]于冰上裂解1.5 h，4 ℃、15 000 r/min离心25 min后取上清加入anti-Flag或anti-HA beads 4 ℃孵育2 h，或将上清与特异蛋白的抗体孵1 h后再加入protein A/G beads 4 ℃孵育2 h，然后用预冷的NP-40缓冲液洗涤5次。按照标准方法进行Western blot分析。

1.2.7 ALDH5A1酶活性的测定：收集约1×106的细胞，4 ℃、800 r/min离心5 min，去上清，用 200 μL平衡至室温的Assay Buffer重悬细胞后，冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r/min离心5 min。根据样品数，将底物及50 μL样品上清加入96孔板中，混匀，室温避光孵育5 min后，用酶标仪测出1.5 h内波长Ex/Em=535/587 nm的酶动力学曲线，根据标准曲线进行计算。

1.2.8 细胞计数实验：用siRNA转染细胞48 h，然后接种于12孔细胞培养皿中，每组接种3×6个重复，培养皿为每孔1×104个细胞，加入1 mL含10%胎牛血清DMEM培养基，每隔24 h每组取3个重复进行细胞计数，共计数6次。

1.2.9 单克隆形成实验：用siRNA转染细胞48 h，然后接种于6孔细胞培养皿中，培养皿密度为每孔2×103个细胞，加入2 mL含10%胎牛血清DMEM培养基。培养10 d后用甲醇固定细胞15 min, 0.05% 结晶紫染色15 min，蒸馏水冲洗后拍照，对单克隆进行计数。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 SIRT5在泛癌中的基因和转录表达水平改变

SIRT5在卵巢癌患者中表现出高频率的基因组改变，高达7%。SIRT5扩增是最常见的改变，在卵巢癌、膀胱癌、黑素瘤、成熟B细胞肿瘤、乳腺癌和肝细胞癌中较其他肿瘤更为常见，此外一些肿瘤在SIRT5中有错义突变和缺失(图1A)。

与正常组织相比，SIRT5在结直肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、子宫肿瘤、急性髓细胞性白血病(acute myelocytic leukemia，AML)、肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma, LUSC)、弥漫性B细胞淋巴瘤(lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma，DLBC)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)、食管癌(esophageal carcinoma，ESCA)、胸腺瘤(thymoma，THYM)、结肠癌(colon adenocar-cinoma，COAD)中的表达水平上调，而在胃癌、睾丸癌和甲状腺肿瘤中的表达水平下调(图1B,C)。

2.2 SIRT5在癌患者中的预后分析

SIRT5的表达水平与乳腺癌(breast cancer)、子宫内膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma)和肉瘤(sarcoma) 患者的总生存率(OS)呈负相关(图2A～C)，而与食管腺癌(esophageal adenocarcinoma)和肺癌(lung cancer)患者的总生存率(OS)呈正相关(图2D, E)。在乳腺癌(GSE2990、GSE9195和GSE11121)数据集)中，SIRT5 mRNA表达较高的患者与表达较低的患者相比，无远处转移生存期(distant meta-stasis-free survival，DMFS)均显著降低(图2F～H)。SIRT5 mRNA高表达组的结肠癌、血液肿瘤与黑素瘤患者生存率也明显低于其低表达组(图2I～L)。

A.SIRT5 alteration frequency, mutation and copy number alteration (CNA) in different databases of human tumors; B.differential SIRT5 expression analysis in human tumors and normal tissues in TNMplot database. Significant differences were marked with red color; C.box plots of SIRT5 mRNA expression based on GEPIA database; *P<0.05 compared with normal tissue

2.3 SIRT5相互作用蛋白质的功能富集分析

SIRT5相互作用蛋白质主要富集到氨基酸、核苷酸和酰胺的代谢过程(图3A)。SIRT5相互作用蛋白质与一个戊二酰化组学数据集存在32个蛋白质重叠，与两个琥珀酰化组数据集存在33个蛋白质重叠(图3B,C)。受SIRT5调控且存在戊二酰化的蛋白在缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、脂肪酸降解、色氨酸代谢、赖氨酸降解和柠檬酸循环上的富集程度较高(图3D)，这与SIRT5调控的琥珀酰化蛋白所富集到的代谢通路较为一致(图3E)。

A-E.the survival curve comparing patients with high (red) and low (blue) SIRT5 expression in multi cancer were retrieved from the Kaplan-Meier plotter analysis; F-L.Kaplan-Meier plots for high and low SIRT5-expressing groups in a series of cancer from the PrognoScan database; survival curve analysis was conducted using a threshold Cox P value<0.05; the dotted lines represented maximum and minimum values of the survival average

2.4 SIRT5与ALDH5A1结合并下调ALDH5A1的琥珀酸化水平

外源ALDH5A1和SIRT5存在相互作用(图4A,B)，在MCF7细胞中能检测到内源性ALDH5A1和SIRT5蛋白之间的相互作用(图4C)。过表达野生型SIRT5可以降低ALDH5A1的琥珀酰化水平，而过表达酶活缺失突变体SIRT5H158Y则没有效果(图4D)。使用两条不同的siRNA敲降SIRT5可以提高HEK293T细胞中ALDH5A1的琥珀酰化水平(图4E)。相比之下，SIRT5过表达或敲低对ALDH5A1的赖氨酸丙二酰化和戊二酰化没有明显影响。

A.pathway enrichment of SIRT5 interaction proteins; B.overlap of SIRT5 interaction proteins and previous glutarylome; C.overlap of SIRT5 interaction proteins and previous succinylome; D,E.pathway enrichment analysis of B,C

A, B.tagged SIRT5 interacted with tagged ALDH5A1; C.endogenous co-immunoprecipitation of SIRT5 and ALDH5A1; D, E.Western blot showing glutarylation, malonylation and succinylation of ALDH5A1 with ectopic SIRT5 wildtype or mutant expression (D) and SIRT5 knockdown (E); F.ALDH5A1 enzyme activity with ectopic SIRT5 wildtype or mutant expression; G.differential ALDH5A1 expression analysis in human tumors and normal tissues in TNMplot database, significant differences are marked with red color; H,I.cell cloning(H)and proliferation(I) experiment of MCF7 cells which expressing ectopic SIRT5 wildtype or mutant expression; J.cell proliferation experiment of MCF7 cells which expressing SIRT5 and transfected with siNC or siALDH5A1; *P<0.05 compared with control group

2.5 SIRT5增加ALDH5A1活性，促进乳腺癌细胞增殖

在细胞中过表达野生型SIRT5会提高ALDH5A1的活性，而过表达SIRT5H158Y没有影响(图4F)。乳腺癌中ALDH5A1的表达水平高于正常组织水平(图4G)。在MCF7细胞中过表达野生型SIRT5可以促进细胞的增殖，而过表达SIRT5H158Y没有效果(图4H,I)。过表达SIRT5的同时敲降ALDH5A1可以抑制这种增殖促进作用(图4J)。

3 讨论

肿瘤的发生发展在很大程度上受转录组和蛋白质组改变的调控。利用cBioPortal在线分析工具展示了SIRT5拷贝数的改变、突变和缺失。其中基因扩增的高频出现暗示这些扩增可能在相关癌的进展和预后中发挥了重要作用。

使用TNMplot和GEPIA数据库进行分析，发现不同癌细胞类型的SIRT5表达模式存在差异，在部分肿瘤的数据集中显著上调。为了更明确地了解SIRT5在癌中的作用，本研究分析了SIRT5在多种癌中的预后状态。利用GEPIA和PrognoScan数据库来分析SIRT5mRNA表达与总生存率的相关性。分析结果表明，SIRT5在乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、血液肿瘤和肉瘤中可能起促癌作用，而在食管腺癌和肺癌中可能起抑癌作用。不同癌中SIRT5表达与预后的不同表明了SIRT5的功能存在异质性，这可能与SIRT5调控的不同分子途径有关。

SIRT5作为Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶家族成员，具有多种去酰化酶活性。琥珀酰化组学和戊二酰化组学所确定的底物主要是控制细胞代谢的蛋白质，包括参与尿素循环、糖酵解和脂肪酸氧化的多种代谢酶。在本研究中，对质谱结果进行蛋白质组学分析，并与之前的戊二酰化组学和琥珀酰化组学数据进行联合分析。结果展示了SIRT5相互作用蛋白所富集到的通路，对后续研究具有指导意义。同时发现SIRT5调控的蛋白中琥珀酰化蛋白和戊二酰化蛋白之间存在大量重叠的代谢途径，说明这两种类型的酰化在调节不同细胞生理功能的同时也可能存在共同调节作用。

对参与柠檬酸循环代谢的酶ALDH5A1进行后续研究，首次发现SIRT5对 ALDH5A1酶活的调控。研究表明SIRT5促进乳腺癌细胞增殖需要ALDH5A1的存在，提示SIRT5与ALDH5A1是促进乳腺癌进展的潜在癌基因。本研究揭示了SIRT5通过去琥珀酰化调控ALDH5A1酶活的重要机制，并为治疗乳腺癌提供了一个潜在的治疗靶点。