Lnc000727促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

蒲 超，张珊珊，吴青霞，罗栩伟，王 亮，张 波*

(川北医学院第二临床学院南充市中心医院 1.骨科; 2.神经内科， 四川 南充 637000)

骨质疏松症(osteoporosis)是一种与年龄相关的系统性骨骼疾病，表现为低骨量和骨组织的微结构性退化，患者发生骨折的风险较高。全球有超过2亿人患有这种疾病，而且这一数字正在逐步增加[1]。尽管近年来已经进行了许多关于骨质疏松症的研究，但是需要探索更有效的骨质疏松症的诊断和治疗靶标[2]。骨质与脂肪量之间的失衡是骨质疏松症发病机制的典型特征[3]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)是具有自我更新和多重分化能力的干细胞。BM-MSCs作为成骨细胞和脂肪细胞的主要来源，维持成骨细胞和脂肪细胞之间的平衡。最近的研究表明，BM-MSCs异常分化能力在骨质疏松症的这一关键发病机制中起着重要作用[4]。因此，确定成骨细胞和脂肪细胞分化的这些关键靶点将对骨质疏松症的早期诊断和治疗大有帮助。长非编码RNA(long noncadling RNA,lncRNA)是一种长于200 nt的RNA分子，不具有蛋白质编码潜能。LncRNA在细胞生物学中的各种重要功能已在众多研究中得到证明[5]。先前的研究表明lncRNA参与BM-MSCs成骨细胞和脂肪细胞的分化[6]。近期发现lnc000727在骨质疏松患者血清中的表达异常升高，提示其可能在骨质疏松症的发生中起重要作用，可能有助于开发骨质疏松症的诊断和治疗标志物[7]。然而，lnc000727在骨质疏松症中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探究lnc000727对成骨细胞分化的影响及潜在机制，以期为骨质疏松症的治疗提供新的靶标。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

人骨髓间充质干细胞hBM-MSCs(中国科学院细胞库)；α-MEM培养基和胎牛血清(Hyclone公司)；胰蛋白酶和青霉素-链霉素双抗(Gibco公司)；Lipofectamine 3000转染试剂(Invitrogen公司)；lnc000727过表达载体质粒及空载、lnc000727 siRNA和siRNA control(广州锐博生物技术有限公司)；β-甘油磷酸钠、抗坏血酸和地塞米松(Sigma-Aldrich公司)；Trizol试剂和反转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)；SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒(南京建成生物科技公司)；RIPA裂解液、BCA试剂盒和ECL化学发光试剂(碧云天生物技术研究所)；RUNX2、OCN、OPN、Wnt和β-catenin单克隆抗体(CST公司)；辣根过氧化物酶标记的IgG(北京中杉金桥生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组和处理：将BM-MSCs培养在α-MEM培养液(含10%胎牛血清和100 U/mL青-链霉素双抗)中，于5% CO2的37 ℃培养箱中培养和传代。对数期的BM-MSCs种植到6孔板中，种植细胞数为1×105个/孔，待细胞增殖至汇合80%时行转染处理，分别将lnc000727过表达载体质粒、空载、lnc000727 siRNA和siRNA control转染至BM-MSCs，具体操作参照Lipofectamine 3000照转染试剂制造商使用说明进行，其中转染lnc000727过表达载体质粒的hBMSC记为lnc000727组，转染空载质粒的BM-MSCs记为pcDNA组，转染lnc000727 siRNA的BM-MSCs记为si-lnc000727组，转染siRNA control的BM-MSCs记为si-NC组。转染6 h后更换成含10%胎牛血清的培养液，转染72 h后采用RT-qPCR检测lnc000727的表达水平，选择成功过表达和抑制lnc000727的细胞株进行成骨细胞分化诱导，诱导培养14 d。成骨细胞分化诱导时，按照参考文献[8]在培养液中添加10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油、50 μg/mL抗坏血酸，每隔1 d更换1次培养液，连续培养21 d。并以未成骨分化诱导的BM-MSCs作为对照(即0 d组)。

1.2.2 酶标仪检测ALP活性：按照ALP检测试剂盒测定ALP活性。简言之，将细胞用PBS洗涤3次/5 min，然后加入适量的对甲苯胺蓝/四唑氮蓝(BCIP/NBT)染色液。将样品在室温下在黑暗中孵育20 min，直到颜色变深，除去工作液，并用蒸馏水洗涤细胞两次以终止反应，并使用酶标仪测定ALP活性。

1.2.3 RT-qPCR检测lnc000727、RUNX2、OCN和OPN mRNA的表达：Trizol法抽提RNA，以反转录试剂盒合成cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒，按照试剂盒使用说明进行扩增。反应结束后分别获取Ct值，以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法分析lnc000727的相对表达水平。引物如下：lnc000727上游引物：5′-CAGCTCGTTCATGGATG CAA-3′，下游引物：5′-GAGAGATGTCATTGCCGCAG-3′；β-actin上游引物：5′-TGGACTTCGAGCAAGAGA TG-3′，下游引物：5′-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′；Runx2上游引物：5′-CCGCCTCAGTGATTTAG GGC-3′，下游引物：5′-GGGTCTGTAATCTGACTCT GTCC-3′；OCN上游引物：5′-CACTCCTCGCCCTATT GGC-3′，下游引物：5′-CCCTCCTGCTTGGACACAA AG-3′；OPN上游引物：5′-ACTCCAATCGTCCCTA CAGTC-3′，下游引物：5′-GACTCACCGCTCTTCATG TG-3′。

1.2.4 Western blot检测RUNX2、OCN、OPN、Wnt和β-catenin蛋白表达：收集各组BM-MSCs，在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液中裂解细胞抽提总蛋白，BCA检测试剂盒测定蛋白质浓度，蛋白质采用SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜上，将膜用含脱脂奶粉的封闭液进行封闭，将膜浸入稀释的相应一抗(其中RUNX2、OCN、OPN一抗均为1∶800稀释，Wnt和β-catenin单抗为1∶500稀释)溶液中，4 ℃过夜，洗涤膜后再浸入到1∶3 000稀释的二抗溶液中，室温孵育2 h，使用化学发光试剂检测蛋白质信号，以GAPDH进行标定。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 人BM-MSCs成骨细胞分化诱导过程中lnc000727的表达变化

与0 d相比，BM-MSCs在成骨细胞分化诱导第3、7、14、21 d时lnc000727的表达水平和ALP活性均显著升高(P<0.05)(图1)。

2.2 抑制或过表达lnc000727对ALP活性的影响

与si-NC组相比，si-lnc000727组转染lnc000727 siRNA 72 h后BM-MSCs中lnc000727的表达显著降低(P<0.05)，成骨分化诱导14 d时ALP活性明显下降(P<0.05)；与pcDNA组相比，lnc000727组转染lnc000727 过表达质粒72 h后BM-MSCs中lnc000727的表达显著升高(P<0.05)，成骨分化诱导14 d时ALP活性明显上升(P<0.05)(图2)。

2.3 抑制或过表达lnc000727对BM-MSCs成骨分化标志物表达的影响

与si-NC组相比，si-lnc000727组中RUNX2、OCN和OPN mRNA和蛋白的表达明显下调(P<0.05)；与pcDNA组相比，lnc000727组中RUNX2、OCN和OPN mRNA和蛋白的表达明显上调(P<0.05)(图3，4)。

*P<0.05 compared with 0 day图1 人BM-MSCs向成骨细胞分化过程中的lnc000727表达和ALP活性变化

*P<0.05 compared with si-NC group； △P<0.05 compared with pcDNA group图2 各组中lnc000727的表达和ALP活性比较Fig 2 Comparison of lnc000727 expression and ALP activity in each group n=3)

*P<0.05 compared with si-NC group；△P<0.05 compared with pcDNA group图3 Western blot检测成骨分化标志物RUNX2、OCN和OPN的表达

*P<0.05 compared with si-NC group；△P<0.05compared with pcDNA group图4 各组中成骨分化标志物RUNX2、OCN和OPN mRNA表达水平比较Fig 4 Comparison of mRNA expression levels of osteogenic differentiation markers RUNX2, OCN and OPN in each group n=3)

2.4 抑制或过表达lnc000727对Wnt/β-catenin信号通路激活的影响

与si-NC组相比，si-lnc000727组中Wnt和β-catenin的表达明显下调(P<0.05)；与pcDNA组相比，lnc000727组中Wnt和β-catenin的表达明显上调(P<0.05)(图5)。

3 讨论

早期诊断和治疗骨质疏松症可以帮助减轻疼痛和症状，并有助于及时的医疗干预。此外，探索引起骨质疏松症的特定基因和确定新的治疗靶标尤为重要。近期随着高通量技术的发展，人们发现了lncRNA，并很快发现了它们的作用以及与各种细胞功能和病理状况的关联。尽管尚未完全阐明lncRNA功能方面的机制细节，但报告仍为它们与成骨基因调控及其发病机制提供了强有力的指示[9-10]。作为成骨细胞和脂肪细胞的主要来源细胞，BM-MSCs在体内和体外均能拮抗成骨细胞或脂肪细胞的分化。从生理上讲，这些分化能力处于平衡状态，并受包括lncRNA在内的各种检查点分子的调节。然而，这些检查点分子的异常表达可能破坏分化平衡，导致异常的骨代谢以及疾病发展[11]。例如，lncRNA H19可以通过miR-29a-3p改变海绵状结构与软骨再生相关来调节成骨作用。此外，在骨关节炎患者中发现H19表达异常[12]。有证据表明，lncRNA GAS5在骨质疏松症患者的骨组织和成骨细胞的主要来源BM-MSCs中均降低，GAS5均可正向调节成骨细胞的分化[13]。本实验首次证实lnc000727能够通过Wnt/β-catenin信号通路促进BM-MSCs成骨细胞分化，抑制骨质疏松症的发展。

*P<0.05 compared with si-NC group；△P<0.05 compared with pcDNA group图5 Western blot检测Wnt和β-catenin的表达Fig 5 Western blot detection of Wnt and β-catenin expression n=3)

许多研究已经证实骨质疏松症患者的骨髓间充质干细胞具有降低的成骨能力，这是导致骨量异常减少的重要原因[14]。但是，尚不清楚lnc000727是否参与了这些过程。本实验结果显示，在BM-MSCs向成骨细胞分化过程中lnc000727的表达逐渐升高，提示lnc000727可能与骨质疏松症的进展有关。此外，功能实验结果发现，过表达lnc000727能够明显促进ALP活性，并促进关键的成骨标志物RUNX2、OCN和OPN的表达，而抑制lnc000727则表现出相反的结果。以上这些结果提示，过表达或抑制lnc000727能够促进或抑制成骨细胞的分化。此外，本实验检测了成骨细胞分化的关键信号通路Wnt/β-catenin相关蛋白分子Wnt和β-catenin的表达，结果显示，过表达lnc000727可促进Wnt和β-catenin的表达，而抑制lnc000727能够阻碍Wnt和β-catenin的表达，这表明lnc000727可能促进Wnt/β-catenin信号通路的活化。

总之，本实验结果发现lnc000727在骨质疏松症患者骨组织中的表达显著升高，且lnc000727能够促进成骨细胞的分化，进而抑制骨质疏松症的进程。本研究表明靶向lnc000727可能有助于骨质疏松症的诊断和治疗。