小鼠乳腺癌肺特异性转移细胞亚系的建立和验证

王子辕，段昭君，罗云萍

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 免疫学系， 北京 100005)

乳腺癌(breast cancer)是全球发病率最高的恶性肿瘤，高居全球女性癌病死率的首位[1]。乳腺癌转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因，90%的乳腺癌患者死亡可以归因于肿瘤的复发或转移[2][3]。乳腺癌常见的转移器官包括骨、肺、肝、脑和淋巴结等，其中肺脏被认为是乳腺癌转移的第二大常见部位[4-5]。肺转移乳腺癌患者治疗后的中位生存期为22个月，5年总生存率仅为16.8%[6]。肺转移严重影响了乳腺癌患者的预后。

乳腺癌转移模型是探究转移嗜器官性分子机制的重要研究工具。其按照建立方法可分为自发性转移模型和实验性转移模型[7]。现阶段的乳腺癌肺转移模型的亲本细胞来源主要集中于高转移细胞系。人源乳腺癌异种移植方面， MDA-MB-231细胞系通过尾静脉注射的方法建立了实验性肺转移模型[8]。鼠源乳腺癌同种移植方面，目前已建立了4T1-luc和4T1的原位肺转移模型[9-10]，但4T1属于高转移细胞系，本身就存在着一定程度的肺转移，筛选的过程只是将原有的肺转移特性放大，因此这些模型均无法很好反应转移器官微环境对肿瘤细胞的影响。4T07是一株低转移能力的细胞系，它有能力离开原发部位却不易形成明显的转移灶[11]。荧光素酶(luciferase)常用于肿瘤研究中的生物发光成像，当与底物结合时可以使转染luciferase的肿瘤细胞在体内发出生物光，通过高灵敏度的光探测器进行成像后可以观察到肿瘤细胞的体内分布，是探究肿瘤发生和转移的常用成像方式[12]。所以研究采用4T07作为亲本细胞构建乳腺癌肺特异性转移细胞亚系4T07LuM，并且通过转染筛选稳定表达luciferase的4T07-luc和4T07LuM-luc细胞来验证体内转移能力，以期为研究乳腺癌的肺转移机制提供合适的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与细胞系： SPF级6周雌性的Balb/c小鼠(中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心)；小鼠乳腺癌细胞系4T07(美国斯克里普斯研究所Ralph A.Reisfeld实验室馈赠)。该动物研究经北京协和医学院伦理审查委员会审查和批准。

1.1.2 试剂：RPMI 1640(Biological Industries公司)；0.25% Trypsin、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液和Opti-MEM(Gibco公司)；Ⅳ型胶原蛋白酶(Thermo Fisher Scientific公司)；VivoGloTMLuciferin和D-luciferin(Promega公司)；苏木精染料和伊红染料(ZSGB-BIO公司)；转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；Polybrene 助感染试剂(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：4T07/4T07LuM细胞系/亚系在含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养。培养温度为37 ℃，气体环境为5% CO2/95%空气，湿度为饱和。对于细胞传代，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，并以1∶3的比例进行传代培养。

1.2.2 实验性肺转移模型的筛选：将处于对数增殖期的小鼠乳腺癌细胞4T07用0.25% EDTA的胰蛋白酶消化，制成5×106个细胞/mL单细胞悬液。每只Balb/c小鼠经尾静脉注射100 μL。2～3周后在无菌条件下对小鼠进行安乐死处理。使用Ⅳ型胶原蛋白酶消化肺脏肿瘤转移灶，并通过70 μm滤膜研磨过滤肿瘤组织，得到细胞悬浮液。将其置于培养箱中培养，4 h后让细胞贴壁，并更换新鲜的完全培养基。体外扩增培养后，将富集培养的细胞再次注射到小鼠尾静脉，重复上述筛选过程3轮，得到细胞亚系4T07lung-S3。

1.2.3 自发性肺转移模型的筛选：将100 μL 5×106个细胞/mL的4T07lung-S3细胞悬液接种到Balb/c小鼠的第4对乳腺脂肪垫中，35 d后对小鼠实施安乐死，消化肺转移的细胞并进行体外扩增培养。之后将富集培养的细胞接种到小鼠的第4对乳腺脂肪垫中，并再次重复自发转移筛选两轮，得到细胞亚系4T07LuM。

1.2.4 Luciferase细胞转染及稳转细胞系的构建：为了实时观察体内的转移情况，本研究构建稳定表达luciferase的细胞系/亚系4T07和4T07LuM，并分别标记为4T07-luc、4T07LuM-luc。转染前1 d将293T细胞铺入6孔板内，待细胞汇合度达到70%左右时进行转染。将luciferase表达质粒和pLP1、pLP2和pLP/VSVG慢病毒穿梭质粒和辅助包装原件载体质粒按照分子质量计算DNA用量，总计2 μg DNA。将2 μg DNA稀释于100 μL Opti-MEM培养基中混匀后静置5 min，同时将2 μL Lipo2000转染试剂置于100 μL Opti-MEM培养基中混匀后静置5 min。将Lipofectamine2000稀释液逐滴加入DNA稀释液中，混匀后静置20 min。再将200 μL转染工作液加入培养液中混匀后置于37 ℃，5% CO2培养，4～6 h后换液。48 h后收取上清病毒，6孔板感染4T07/4T07-LuM细胞，在不含双抗的完全培养基中，每孔加入1 mL病毒原液并添加2 μg/mL的助感染试剂polybrene，6 h后换液。感染病毒后的细胞增殖汇合达到80%时，更换为新鲜的含嘌呤霉素的培养基处理细胞。直至未感染的空白对照组细胞全部死亡后，更换完全培养基进行扩大培养。

1.2.5 小动物活体成像检测体内转移情况：使用PBS配制150 mg/mL的D-luciferin储存液(10×工作液)，-80 ℃保存。实验前，使用PBS稀释D-luci-ferin储存液至1×工作液。将荷瘤小鼠放置于麻醉箱通入异氟烷麻醉。腹腔注射D-luciferin工作液(10 μL/g)，10 min后将小鼠放置于活体成像箱中进行成像拍照，并且记录数据。

1.2.6 石蜡包埋切片及苏木精和伊红染色检测肺转移灶：为了进一步探究luciferase荧光信号是否意味有肿瘤灶或病变的存在，将原位接种4T07-luc和4T07LuM-luc细胞的小鼠的肺组织切片进行了HE染色。将安乐死的小鼠手术取出肺组织后，立即放入4%多聚甲醛溶液中固定2 d。流水漂洗组织块后，使用梯度浓度的乙醇溶液脱水组织，然后使用二甲苯进行透明处理，浸蜡后将组织整理包埋于石蜡块中。对包埋材料进行修整后，固定在切片机上，4 μm组织切片，将切片于温水中展片，并用载玻片从一侧捞片后放置于60℃的烤片机上烤干。

将石蜡包埋的切片浸入梯度浓度的乙醇中进行脱蜡处理。复水后，依次用苏木精染色，用盐酸乙醇进行分化，用氨水漂洗返蓝，脱水后再用0.5%伊红乙醇溶液复染。在每张载玻片上滴一滴中性树脂，并覆盖盖玻片。制好的玻片在显微镜下观察，对核质深染的区域进行拍照统计。

1.2.7 细胞划痕愈合实验和Transwell小室法检测体外迁移和侵袭：为了探究4T07LuM细胞体外迁移和侵袭水平变化，将4T07和4T07LuM细胞接种于24孔板内，每孔接种5×105个细胞，每组3个复孔。待细胞汇合至90%时，使用黄枪头在每个孔中沿小孔直径垂直划线，然后给每个孔换液去除脱落的细胞，将孔中完全培养基换成含1% FBS的培养基进行培养。0、24、48 h内镜下观察孔内划痕宽度的变化，每个孔内选取3个独立视野进行拍照，统计划痕愈合比例。

重悬4T07和4T07LuM细胞至1×106个/mL，在24孔小室(先铺1%FBS的培养基)中加200 μL的细胞悬液。将小室悬挂于24孔板中，板孔加入500 μL的10% FBS完全培养基。培养12 h后，将小室从细胞板中取出，PBS清洗后，多聚甲醛固定。再次用PBS清洗后，将小室浸没于结晶紫染料中染色，染色结束后蒸馏水清洗并用棉签擦拭，显微镜下观察并统计迁移至小室膜外侧的细胞数。

1.2.8 流式细胞测量术分析免疫细胞浸润丰度：为了探究小鼠体内免疫微环境的改变，在安乐处死4T07和4T07LuM荷瘤小鼠后，使用酒精对肿瘤周围进行消毒，取出小鼠的脾脏、原位肿瘤和肺脏，脾脏直接置于基本培养基中研磨，70 μm滤膜过滤细胞悬液；原位肿瘤和肺脏切碎后加入5 mL Ⅳ型胶原酶工作液，摇床消化2 h，70 μm滤膜过滤细胞悬液；将上述的细胞悬液混匀离心后加入裂红液，裂解红细胞结束后将入完全培养基终止裂解，离心后重悬即得到可用于上机检测的单细胞悬液，细胞计数5×105个细胞，离心后100 μL PBS重悬。向100 μL的细胞悬液中加入1 μL抗体。4 ℃避光孵育30 min，再次离心后弃去上清。然后用PBS洗涤细胞2次，500 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测免疫细胞浸润相对比例，采用FlowJo软件进行结果统计。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠乳腺癌肺转移细胞亚系4T07LuM的构建流程

细胞亚系4T07LuM构建过程经由多轮体内筛选(图1A)。先经过3轮实验性转移筛选，尾静脉接种5×105个/100 μL 4T07细胞，2周后发现肺出现明显的肿瘤转移结节，而肝脏和脾较为正常，未发现有转移灶(图1B)。将肺转移肿瘤细胞体外富集培养后，得到细胞亚系4T07lung-S3。然后进行自发性转移筛选，小鼠腹部第4对乳腺脂肪垫原位接种4T07lung-S3细胞，35 d左右消化肺脏中的肿瘤组织，体外富集培养得到4T07LuM细胞。

A.flow chart of cell subline 4T07LuM construction and screening; B.tumor metastasis in lung, liver and spleen of mice 2 weeks after tail vein inoculation

2.2 4T07LuM细胞较原代细胞的形态学变化

筛选所得的4T07LuM镜下细胞形态学变化不明显，细胞贴壁增殖黏附排列，大小较为一致，细胞形状呈现梭型和球型，细胞边界明显，细胞数量也没有发生明显变化(图2)。

2.3 4T07LuM细胞肺特异性转移情况

与对照组4T07-luc相比，4T07LuM-luc组小鼠发生了明显肺转移的情况(图3A)。安乐处死小鼠后，分离出小鼠的各个器官检测肿瘤的转移情况，心脏和肺脏处能够检测出较强的荧光强度，肝脏中只检测出微弱的荧光强度(图3B,C)，其余器官均无法检测出荧光信号，证实4T07LuM具有肺特异性转移的能力。

2.4 病理检测4T07LuM细胞的肺转移灶

与活体成像结果一致，相较于4T07组， 4T07LuM组肺的HE染色结果可以观察到正常组织细胞周围出现了异型性细胞，核质深染，胞核体积和核质比例增大，可观测到双核或多核细胞，证实为肿瘤细胞(图4)。

图2 显微镜下4T07LuM细胞形态Fig 2 4T07LuM microscopy-based cell morphology

A.tumor lung metastasis 35 days after in situ vaccination for breast cancer; B.4T07LuM-luc metastasis in each organ after in situ vaccination (total imaging); C.4T07LuM-luc metastasis in each organ after in situ inoculation (separate imaging)

2.5 4T07LuM细胞的迁移能力增强

4T07和4T07LuM两株细胞在0、24、48 h时进行细胞划痕愈合检验(图5A)，4T07LuM组的划痕愈合比例要明显高于4T07组，24和48 h时4T07LuM细胞的迁移能力分别是亲代细胞4T07的1.28(P<0.01)和1.64倍(P<0.001)。此外，与4T07相比，4T07LuM迁移过小室的结晶紫染色细胞数量显著提高(图5B)，4T07LuM细胞的迁移能力是亲代细胞4T07的1.91倍(P<0.001)。

2.6 4T07LuM细胞的免疫微环境更倾向于免疫抑制状态

原位接种4T07LuM细胞后，相较于亲代细胞4T07，免疫微环境也发生了一定程度的改变。脾脏中CD4+和CD8+T细胞比例明显降低(P<0.001,P<0.05)(图6A)，原位灶中M2和B细胞的比例明显上调(P<0.05,P<0.01)(图6B)，肺转移灶中CD4+和CD8+T细胞比例也明显降低(P<0.001,P<0.05)(图6C)。

3 讨论

乳腺癌转移是个复杂多级联的过程，需要肿瘤细胞从原发部位进行扩散，渗透进入循环系统，然后外渗到远端转移器官并且完成定植。乳腺癌转移模型就是围绕各个转移步骤而建立的实验研究工具[7]。现阶段研究集中于肿瘤自身对转移的影响，目前广泛使用的人源性乳腺癌肺转移模型MDA-MB-231-LM2细胞缺乏完整免疫系统背景[13]。而本研究筛选得到的4T07LuM，优势在于可以接种具有完全免疫的小鼠，更全面地反应免疫微环境对肿瘤转移的影响。本研究发现原位接种4T07LuM细胞后，正向杀伤肿瘤的免疫细胞浸润减少，而促进肿瘤生长转移、发挥免疫抑制作用的免疫细胞浸润增多，肿瘤和肺脏的免疫微环境更倾向于免疫抑制的状态。与本研究一致的是，原位灶和远处转移器官的免疫环境都影响肿瘤转移的进程，转移性肿瘤相比原发性肿瘤具有更低的免疫原性[14]，而且肺作为远处转移器官接受肿瘤定植需要高度依赖免疫抑制的微环境[15]。4T07LuM细胞模型将免疫系统引入到转移级联中，可以探究早期原位灶的肿瘤细胞如何逃脱免疫监视进入循环系统，以及如何塑造远处转移器官的免疫抑制微环境，并形成易于肿瘤定植的转移前生态位。

目前乳腺癌转移的治疗效果不佳，部分原因是缺乏预测方法来确定患者哪些器官容易发生转移，故亟需器官特异性转移模型的基础研究为预防治疗提供新靶点。本研究利用4T07细胞几乎无法形成转移灶的细胞特性，在接受多轮肺脏微环境“驯化”后，它的体外侵袭和迁移能力都显著增强，进一步的体内实验结果又显示出其肺转移的特异性，即肺脏高度转移的同时却在其他器官很少观察到转移灶的形成。相较于高转移的4T1细胞原位肺转移模型，4T07LuM细胞体现出微环境对肺转移的影响，更容易富集到肺特异性转移的关键基因。由于4T07LuM细胞同时具备了肺特异性和高转移性的特点，测序比较两株细胞系4T07和4T07LuM可以寻找影响肺转移的新型生物标志物，为乳腺癌转移的临床诊断提供更丰富的依据和更准确的治疗策略。

图4 4T07/4T07LuM细胞原位接种后肺的HE染色Fig 4 HE staining of lung after 4T07/4T07LuM cells inoculation in situ(×40; ×100; ×200)

A.wound healing assays of 4T07/4T07LuM cells(×40); B.Transwell assays of 4T07/4T07LuM cells(×100); *P<0.01, **P<0.001 compared with 4T07 group

此外本研究仍存在一些局限性，例如4T07LuM细胞作为小鼠乳腺癌细胞系，无法同基因工程模型小鼠一样地准确探究肿瘤休眠机制，而且乳腺癌的异质性和临床转化的复杂性限制了该模型的应用。

A.proportion of CD4+ and CD8+ T cells in spleen; B.proportion of M2 and B cells in tumor immune microenvironment; C.proportion of CD4+ and CD8+ T cells in metastasis; D.figure 6 (A-C) statistical results of immune cell infiltration; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 4T07 group

综上所述，本研究建立了来自低转移细胞系分离出器官特异性的高转移细胞亚系的一般方法，构建并验证了4T07LuM细胞肺特异性转移细胞亚系，为临床转移癌的研究提供了新实验模型。