乳腺癌缺失因子1(DBC1)影响乳腺癌细胞系对依托泊苷的敏感性

韩雪莹，崔 丰，李 隽

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系，北京 100005)

乳腺癌(breast cancer)是全世界女性最常见的恶性肿瘤[1]，其中，三阴性乳腺癌(指雌激素受体，estrogen receptor，ER、孕激素受体，progesterone receptor，PR和人表皮生长因子受体2 ，human epidermal growth factor receptor 2，HER2均为阴性的乳腺癌)(triple-negative breast cancer, TNBC)是难治疗的乳腺癌亚型之一。降低乳腺癌病死亡率的关键是早期诊断和治疗[2]，传统的预后和预测指标不能达到早期诊断的目的[3]。因此需要新的标志物来尽早帮助区分预后是否良好。乳腺癌缺失因子1(deleted in breast cancer 1, DBC1)是一种核蛋白，因最初被发现在乳腺癌中发生8p21区域的纯合子缺失而得名[4]。DBC1参与了DNA损伤修复(DNA damage repair, DDR)，在DNA损伤时，DBC1通过抑制SIRT1，促进p53乙酰化从而诱导细胞凋亡[5]。DNA损伤反应会激活DNA损伤修复途径[6]，有研究表明DNA损伤修复蛋白、RecQ家族DNA解旋酶之一的Bloom综合征蛋白(Bloom’s syndrome helicase, BLM)的突变会呈现出肿瘤易感性和早衰[7-8]，而且BLM在体内和体外能够结合p53介导细胞凋亡[9]。另有研究表明三阴性乳腺癌细胞系HCC-70和MDA-MB-231对黄连素的敏感性不同[10]。因此，本研究将从比较两种细胞中的DBC1与BLM的相对蛋白水平差异入手，探究它们在乳腺癌细胞中对DNA损伤试剂诱导凋亡的敏感性的影响和可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人乳腺导管癌细胞系HCC-70，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，人胚肾细胞系HEK-293T (中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)。

1.1.2 试剂和试剂盒:无四环素的胎牛血清(Gibco公司)；青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司)；DMEM培养基、RPMI 1640培养基(Corning公司)；Annexin Ⅴ凋亡检测试剂盒(Biolegend公司)；CCK8(北京聚德安泰有限公司)；DBC1抗体、BLM抗体(Bethyl Labotatories公司)；p21抗体(BD Biosciences公司)；GAPDH抗体(Millipore公司)；ML216(MCE公司)；依托泊苷(etoposide,Etop)(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及转染：将HEK-293T细胞培养于DMEM培养基中(含10%胎牛血清、1%的青霉素和链霉素)，在6孔板中接种细胞，待细胞增殖至50%～60%汇合时，将目的质粒1 μg、包装质粒psPAX2 7.5 μg、包膜质粒pMD2.G 2.5 μg按Lipofectamine 2000 Reagents说明书加入DMEM中，静置5 min，加入HEK-293T细胞中。48 h后收集病毒上清，并经0.45 μm滤膜过滤。

1.2.2 稳定转染细胞株的建立：将HCC-70细胞培养于DMEM培养基中(含10%胎牛血清、1%的青霉素和链霉素)，待增殖至50%～60%汇合时加入病毒上清和8 μg/mL的Polybrene，48 h后更换新鲜完全培养基并加入2 μg/mL嘌呤霉素进行筛选，建立稳定传代的细胞株。

1.2.3 CCK-8法测定细胞存活率：将细胞按5×103个/孔接种到96孔板中，每组实验设置3个复孔，继续培养24 h，etoposide(100 μmol/L，48 h)或与ML216(50 μmol/L，48 h)[11]联合处理后，将10 μL CCK-8和100 μL PBS加入每个孔中，在37 ℃，5% CO2下再培养2 h。最后，使用酶标仪测量450 nm的吸光度值以代表细胞存活率。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡：收获etoposide (100 μmol/L，48 h)或与ML216(50 μmol/L，48 h)[11]联合处理后的各组细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次并细胞计数，1 000 r/min离心5 min，用1×结合缓冲液将细胞稀释成1×106个/mL，取100 μL细胞悬浮液，先后加入annexin Ⅴ和PI工作液各5 μL，混匀后室温避光孵育15 min后，补加1×结合缓冲液400 μL后，1 h内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.2.5 Western blot检测不同组细胞中DBC1，BLM，p21蛋白的表达水平：胰蛋白酶消化etoposide(100 μmol/L，48 h)处理后的各组细胞，用PBS缓冲液洗1遍，1 000 r/min，5 min离心收获细胞。使用Triton-X 100裂解液裂解，冰上孵育30 min，13 500 r/min离心10 min，取蛋白质上清于离心管中。然后使用分光光度计测595 nm的吸光度值然后根据标准曲线计算蛋白质浓度。制备相同蛋白质量的样品，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后300 mA转膜1 h。5%的脱脂牛奶封闭10 min，孵育一抗(1∶1 000)过夜。孵育二抗(1∶3 000)1 h后显影并分析结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 MDA-MB-231比HCC-70细胞对Etop诱导的凋亡更加敏感

HCC-70细胞在DNA损伤前后，细胞存活率的变化没有统计学意义，而MDA-MB-231细胞则在DNA损伤后细胞存活率显著降低(图1A)。HCC-70细胞在DNA损伤后细胞凋亡水平的变化没有统计学意义，MDA-MB-231细胞在DNA损伤后细胞凋亡水平显著增加(图1B，C)(P<0.001)。

2.2 HCC-70和MDA-MB-231中DBC1和BLM的蛋白水平有负相关性

分析癌细胞系百科全书数据库 (Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE)中乳腺癌细胞相关信息，发现DBC1与BLM在乳腺癌细胞中的表达呈负相关(图2A)。HCC-70细胞相比较MDA-MB-231细胞，DBC1蛋白水平较高，BLM蛋白水平较低。当使用Etop诱导DNA损伤后， BLM蛋白水平在两种细胞中均减少，但是HCC-70降低的更多；同时细胞周期调控蛋白p21蛋白水平均升高，但是在HCC-70细胞中上升的更加明显(图2B)。

2.3 敲低DBC1的HCC-70细胞的凋亡水平与MDA-MB-231细胞接近

敲低DBC1的HCC-70细胞中DBC1水平与MDA-MB-231接近。在Etop诱导DNA损伤后，敲低DBC1的HCC-70中，BLM的蛋白水平上升，p21蛋白水平下降，这些变化均与MDA-MB-231的表现接近(图3A)。同时，敲低DBC1使HCC-70的细胞存活率下降(图3B)；细胞凋亡率上升(图3C，D)；两个参数的测量结果均与MDA-MB-231的数据接近。

A.CCK-8 kit was used to detect the survival rate of HCC-70 and MD-MB-231 cells treated with Etop; *P<0.001 compared with MDA-MB-231 no treament group; B.HCC-70 and MD-MB-231 cells were treated with Etop, and cells apoptosis rates were detected by annexin V-APC/PI staining,*P<0.001 compared with MDA-MB-231 no treament group; C.relative apoptosis rate was normalized to no treatment

A.Pearson correlation of DBC1 and BLM relative expressions in breast cancer cells (data from CCLE database),r=0.425 0; B.Western blot was used to detect BLM, DBC1 and p21 protein levels in HCC-70 and MDA-MB-231 cells treated with Etop

A.Western blot was used to detect BLM, DBC1 and p21 protein levels in DBC1 knockdown HCC-70 cells and MDA-MB-231 cells treated with Etop; B.CCK-8 kit was used to detect the survival rate of DBC1 knockdown HCC-70 cells and MD-MB-231 cells treated with Etop; **P<0.001 compared with HCC-70 shCtrl Etop group; C.DBC1 knockdown HCC-70 cells and MD-MB-231 cells were treated with Etop, and cells apoptosis was detected by annexin V-APC/PI staining; D.relative apoptosis rate was normalized to no treatment; *P<0.01 compared with HCC-70 shCtrl Etop group

2.4 ML216和Etop的联合用药能够增加MDA-MB-231的细胞凋亡

Etop和ML216联合用药后，HCC-70细胞的存活率和凋亡率与单独使用Etop相比没有明显变化，而在MDA-MB-231细胞中联合用药能够显著降低肿瘤细胞存活率，增加细胞凋亡水平，敲低DBC1的HCC-70的细胞存活率和凋亡率的联合用药效果介于HCC-70和MDA-MB-231之间并向后者接近(图4)。

2.5 三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系中DBC1表达较高而BLM表达较低

分析CCLE数据库中61种乳腺癌细胞的DBC1的表达发现，其中6种的DBC1表达较高，而BLM表达较低的细胞均为三阴性乳腺癌类型(图5)。

A.CCK-8 kit was used to detect the survival rate of DBC1 knockdown HCC-70 cells and MD-MB-231 cells treated with Etop and ML216; *P<0.01 compared with MDA-MB-231 Etop group; B.DBC1 knockdown HCC-70 cells and MD-MB-231 cells were treated with Etop and ML216, and cells apoptosis were detected by annexin V-APC/PI staining; C.the relative apoptosis rate was normalized to no treatment; *P<0.01 compared with MDA-MB-231 Etop group

图5 DBC1和BLM的负相关性在TNBC中表现明显Fig 5 Negative co-relation of DBC1 and BLM is relatively more prominent in TNBC

3 讨论

三阴性乳腺癌(TNBC)是最具侵袭性的乳腺癌类型之一，其特点是快速复发、早期转移和预后不良[12]，TNBC的及时发现并判断严重程度对于治疗方案的选择和效果具有重要意义。有研究表明，聚ADP-核糖聚合酶(PARP)是治疗乳腺癌基因1和2(BRCA1/2)缺陷肿瘤细胞的治疗靶点[13]。BRCA和PARP共同参与DNA损伤修复机制，两个基因的功能同时丧失导致细胞死亡，但是其中之一的突变或缺陷不影响细胞存活，所以对于含有BRCA1/2突变的癌细胞使用PARP抑制剂 (PARPis) 增加了肿瘤杀伤药物的作用，这种现象称之为“合成致死效应”[14]。本研究中，BLM抑制剂ML216能够加强etoposide对MDA-MB-231细胞的杀伤作用，而对HCC-70细胞没有这种作用，其中可能的原因是MDA-MB-231细胞中BLM蛋白水平相对较高。BLM是一种DNA损伤修复蛋白，ML216降低了BLM介导的DNA损伤修复效率，促使细胞凋亡增加，因而增加了Etop对DBC1蛋白水平相对较高的MDA-MB-231细胞的敏感性。而在HCC-70细胞中BLM蛋白水平较低，说明这类癌细胞可能对BLM蛋白介导的同源重组DNA损伤修复途径的依赖性较低，亦或有其它DNA损伤修复途径代偿性弥补了BLM的功能缺失。因此，在HCC-70细胞中ML216没有对DNA损伤试剂起到增敏作用。以上研究表明，ML216可能会为某些乳腺癌类型的治疗提供一种“合成致死”联合用药的新选项。

此外，两种乳腺癌细胞中DBC1和BLM蛋白表达呈负相关，并且在61种乳腺癌细胞中发现其中6种三阴性乳腺癌细胞具有较高的DBC1蛋白水平，而BLM蛋白水平表达较低，说明在三阴性乳腺癌中这两种蛋白的负相关关系表现的更为明显。由此推测，DBC1和BLM蛋白表达量的比值可能与乳腺癌的恶性度分型有关，或者能够成为TNBC诊断的参考指标之一。当然，要证明这一推断还需要后期对大规模乳腺癌患者基因序列的分析来确认。同时，进一步探究DBC1如何负向调控BLM表达水平可能会为TNBC发病机制的研究提供一个新的角度。