新型微量注射装置在建立帕金森病模型小鼠中的应用

左赋兴，苑 青，蔡洪庆，韩睿钦，万经海

(1.国家癌症中心 国家肿瘤临床医学研究中心 中国医学科学院 北京协和医学院 肿瘤医院 神经外科，北京 100021；2.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是常见的运动障碍性疾病，严重威胁60岁以上人群的健康[1]。动物模型是疾病研究的重要工具，其中6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)小鼠单侧纹状体注射是构建PD模型小鼠常用的方法之一[2-6]，通过观测行为学表现和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)免疫组化染色来评估模型效果[3, 7]。该PD模型制作的关键是精准微创穿刺小鼠纹状体特定位置[4, 6]。普通微量注射器穿刺损伤大，严重影响模型的一致性和稳定性。本研究应用新型微量注射装置进行6-OHDA脑内注射，从行为学和形态学等方面探讨其建模效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级10周龄健康雌性C57BL/6J小鼠20只，体质量20～25 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。动物饲养及相关实验在中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心[SYXK(京)2019-0019]实施。动物实验全过程遵照实验动物操作指南，并经中国医学科学院肿瘤医院实验动物伦理委员会批准[NCC2020A200]。随机分为对照组和实验组，每组10只小鼠，分别用普通微量注射器(对照组)和新型微量注射装置(实验组)进行单侧纹状体6-OHDA注射。

1.2 实验器械

体视镜(Olympus公司)；Eclipse 90i显微镜(Nikon公司)；Stereo Investigator(Micro-Bright Field Bioscience公司)；激光共聚焦显微镜、冰冻切片机(Leica公司)；OCT冷冻切片包埋剂(Sakura公司)；用于颅内立体定向注射的微量注射装置(ZL201520328267.3)(图1A)、微量注射器(Hamilton公司)；微量注射泵(兰格恒流泵有限公司)；立体定向仪、动物手术器械、牙科磨钻(Stoelting公司)；P40 pro智能手机(华为技术有限公司)。

1.3 主要药品及试剂

6-OHDA、地昔帕明(desipramine)、抗坏血酸(ascorbic acid)、阿扑吗啡(Apomorphine, Apo)(Sigma-Aldrich公司)；10%水合氯醛溶液(中国医药集团有限公司)；Vectastain Elite ABC Kit (Universal)、封闭用马血清(Vector laboratories公司)；兔抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体、兔抗SRY-box转录因子2(SRY-box transcription factor 2, Sox-2)抗体、鸡抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗体(Millipore公司)；Alexa Fluor® 594 goat anti-chicken二抗、Alexa Fluor® 647 donkey anti-rabbit二抗(Life Technologies公司)；苏木精(北京化工厂有限责任公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备:6-OHDA单侧纹状体注射如前述[2]。实验前30 min小鼠腹腔注射地昔帕明(0.01 mL/g 体质量)。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后将小鼠固定于立体定向仪上。消毒并切开头皮显露前囟点，于前囟点前0.9 mm、左侧旁开2.2 mm处钻孔。实验组以新型微量注射装置缓慢下行穿刺至硬膜下2.5 mm缓慢注射6-OHDA溶液(含0.02%抗坏血酸)3 μL(注射泵速度0.5 μL/min)，注射完毕后留针2 min。缓慢匀速撤出注射装置并缝合头皮。对照组以普通微量注射器操作。

1.4.2 旋转实验:建模后7 d，观察小鼠有无尾僵竖毛等异常行为，并于建模后7 和28 d进行旋转实验。小鼠腹腔注射Apo溶液后(5 μg/g体质量)，将动物单只置于笼中，手机摄像连续记录30 min内小鼠向健侧旋转圈数。

1.4.3 免疫组化染色:建模后28 d用10%水合氯醛过量麻醉小鼠后，行4%多聚甲醛心脏灌注和脑组织固定。30%蔗糖溶液脱水后包埋于OCT中，冰冻切片机冠状位连续切片，厚度30 μm，置于切片抗冻剂中-20 ℃保存。取中脑黑质层面脑片行TH染色(一抗稀释浓度1∶800)，显色后苏木精复染，封片并在体视镜下观察计数。取纹状体层面脑片行GFAP(glial fibrillary acidic protein)和Sox2免疫荧光染色(一抗稀释浓度分别为1∶600和1∶100)，二抗孵育后抗淬灭剂封片并在激光共聚焦显微镜下观察计数。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 行为学表现

实验组小鼠在观察周期内均存活，建模后7 d，尾僵竖毛等异常行为发生率为90%(9/10)；6-OHDA注射后7和28 d均可被Apo诱导出现向健侧旋转行为(100%)，30 min平均旋转圈数分别为189.4 ± 12.8和195.2 ± 12.7(n=10)(图1B)。对照组动物建模后7 d内死亡2只，其余存活小鼠尾僵竖毛等异常行为发生率为75%(6/8)；建模后出现Apo诱导的旋转行为5只(62.5%)，7和28 d的平均旋转圈数分别为173.6 ± 20.5和139.2 ± 24.1(n=5,P<0.05)；建模28 d旋转圈数减少，与实验组统计学差异显著(P<0.05)(图1B)。

2.2 免疫组化染色

与对照组相比，建模后28 d实验组小鼠患侧黑质TH阳性的多巴胺能神经元数量为(2 502.0±505.9)个(n=10)，较对照组(3 792.9±1 048.3)个(n=5)显著减少(P<0.05)(图2A～C)。此外，对照组患侧纹状体内反应性增生的星形胶质细胞增多，且部分具有神经前体细胞特性，表达Sox2(图2D)，提示对照组机械损伤大，星形胶质细胞被激活。

3 讨论

小鼠脑内立体定向注射6-OHDA是研究PD的常用模型之一，模型制作易操作，动物异常行为稳定持续时间长[3-4]。其最大优势在于可形成自身对照，注射侧多巴胺能神经元大量死亡，Apo诱发小鼠旋转圈数与损伤程度正相关，便于进行模型量化评价[3, 6]。且6-OHDA在脑内形成的病理生理反应渐进而稳定，与人类PD的疾病过程更接近[6-7]。但6-OHDA不能透过血脑屏障，必须直接脑内给药。该PD模型的制作需要在立体定向仪器引导下穿刺小鼠脑内特定坐标点，缓慢注射6-OHDA，使药物与脑内微环境充分接触并有效弥散，从而发挥毒性作用[2-3, 5]。

模型动物的基本要求是一致性和稳定性[3-5]。

A.higher magnification image demonstrated that the diameter of the glass cannula tip was 30 μm, which was much smaller than regular Hamilton syringe, resulting in mild impairment; B.6-OHDA-induced lesioning at day 7 in both control and experimental groups could be observed, while significant reduction in the number of rotations was detected in control mice; *P<0.05 compared with control

The overall number of dopaminergic neurons in the substantia nigra in experimental mice (A) was still smaller than that of cells in control animals (B); quantification of nigral TH positive cells (C) revealed significant difference between these two groups; more reactive astrocytes (D, red) were observed in the striatum of control mice, some of which co-localized with Sox2 (D, green) (arrows in D);*P<0.05 compared with control, two tailed Student’s t-test； scale bars represent 200 μm in (A, B); scale bar=20 μm in (A,B,D)

小鼠纹状体体积较小，操作精度要求高。但普通微量注射器针头尖端为斜口状，直径约500 μm，且为金属材质，进入脑组织后机械损伤大，易导致动物死亡，不符合PD病理改变，更不利于后续实验。本研究的对照组动物死亡率达20%，免疫组化提示穿刺部位周围大量增生星形胶质细胞，因此损伤范围大和脑水肿是动物死亡主要原因。对照组小鼠仅5只(50%)出现旋转行为，模型一致性差；且28 d的旋转圈数较7 d显著下降，模型稳定性不佳。

为解决上述问题，实验组应用新型微量注射装置(图1A)以提高模型制作成功率。该装置主要由无菌玻璃针组成，神经组织相容性好；注射器连接微量进样泵，可稳定微调6-OHDA注入速度，操作便捷；玻璃针尖端直径仅30 μm，脑损伤极小，有效降低了建模后动物死亡率。实验组小鼠在观察周期内无死亡，尾僵竖毛等PD相关症状发生率为90%；所有动物均在Apo诱导下出现典型旋转行为，建模28 d和7 d的旋转圈数差异无统计学意义，从动物行为层面提示模型一致性和稳定性俱佳。组织学研究发现，实验组黑质多巴胺能神经元数量较对照组处于稳定低水平，进一步证实新型微量注射装置可提高模型动物制作成功率。

综上所述，实验组模型动物成功率为100%，因此本研究推荐在脑内注射6-OHDA制备PD模型小鼠时应用该新型微量注射装置，为后续疾病治疗相关研究提供高效实验工具。今后更可利用该装置开展动物脑内干细胞移植工作，观察评估其在促进移植成功率等方面的作用。