微小RNA-488对非小细胞肺癌A549干样特性和裸鼠移植瘤生长的影响

任吉莲 崔灵芝 郝小夏 李晓颜 常彦祥

(1山西医科大学汾阳学院医学检验系，山西 汾阳 032200；2山西省肿瘤医院干部诊疗科；3山西省汾阳医院检验科；4西安医学院第一附属医院)

非小细胞肺癌(NSCLC)是全世界癌症死亡的主要原因之一，每年约有超过100万人因NSCLC死亡〔1〕。在最近的几十年中，由于诊断、手术和联合治疗等方法的改进，NSCLC患者的生存率有了显著提高。由于NSCLC有极高的复发率和转移率，5年生存率仅为15%〔2〕。因此深入研究NSCLC发生发展的分子机制，确定新的治疗靶点,对于改善NSCLC患者的治疗现状具有重要意义。

微小RNA(miRNA)由18～25个核苷酸组成，是一类内源性核糖调节因子，可通过RNA干扰途径调节基因表达〔3〕。研究报道人类miRNA在细胞增殖、凋亡和分化中发挥生理作用〔4〕。某些miRNA可能是癌症诊断和预后的标志物〔5〕。研究表明miR-488在多种肿瘤中表达异常，可作为抑癌基因〔6,7〕。研究表明miR-488通过真核起始因子(eIF)3a介导的NER信号通路抑制NSCLC细胞的增殖和顺铂敏感性〔8〕。但miR-488对NSCLC的具体作用机制仍不清楚。本文旨在探究miR-488对NSCLC A549干样特性和裸鼠移植瘤生长的影响。

1 材料和方法

1.1实验动物 10只Balb/c裸鼠购自北京维通利华维通利华动物科技有限公司，雄性，5周龄，体重(20±2)g，许可证号：SCXK(京)2015-0001，在特定的无病原体条件下饲养。

1.2试验试剂 DMEM培养基(12100-046)、青-链霉素(15140-122)、胎牛血清(26400-036)、胰蛋白酶(15050-057)和F12培养基(21700-075)购自美国Gibco公司；LipoRNAiTM转染试剂(C0535)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(P0012)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(C1062M)、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(C1091)购自上海碧云天生物技术研究所；anti CD44(ab157107)、干细胞转录因子(SOX)2(ab97959)、八聚体结合因子(OCT)4(ab18976)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3(ab13847)、Caspase-9(ab52298)购自美国Abcam公司。

1.3细胞培养 人支气管上皮细胞BEAS-2B、人腺癌细胞PC-9、人肺黏液上皮样癌细胞H292，人非NSCLC细胞A549来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，将细胞培养于含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基中，于37℃，5%CO2的培养箱中培养，每24 h更换新鲜培养基，1∶2传代。选用对数生长期细胞为实验细胞。

1.4细胞处理及分组 按照1×105个/孔的密度将细胞接种于6孔板内，待60%融合度时更换为无血清培养基。采用LipoRNAiTM转染试剂将mimic-NC和miR-488 mimic组转染至A549细胞，将细胞随机分为3组：Control组、mimic-NC组和miR-488 mimic组。

1.5RT-PCR 用Trizol法从BEAS-2B细胞、PC-9细胞、H292细胞和A549细胞中提取总RNA，用Nanodrop 分光广度计测定吸光度(A260/A280)，按照试剂盒说明书进行cDNA的合成和PCR的扩增，PCR扩增的条件为：94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环，最后72℃延长10 min。于凝胶成像系统中检测表达情况。

1.6成球实验 将各组细胞经流式细胞仪计数后铺至超低黏附96孔板。每孔100 μl F12成球培养基，含10个活细胞，各铺10个复孔。静置培养14 d后倒置显微镜下观察细胞成球率及细胞成球直径。细胞成球率=每孔细胞成球球数目总数/每孔细胞数×100%。

1.7流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期的各组A549细胞，接种于5孔板中，用流式细胞仪按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行检测，计算各组A549细胞细胞凋亡率。

1.8Western印迹 取各组待测细胞，加含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，用BCA试剂盒提取总蛋白并测定蛋白质含量。提取等量的蛋白质样品，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，加入相应的一抗(CD44、SOX2、OCT4、Caspase-3、Caspase-9)，4℃过夜孵育后用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)清洗并加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的Ⅱ抗室温孵育1 h。加入电化学发光(ECL)试剂曝光显影，凝胶成像系统分析胶片灰度值并计算相对表达量。以GAPDH为上样量参照，重复3个独立的实验。

1.9裸鼠移植瘤模型的建立 参照郑兴等〔9〕方法，取对数期生长的Control组、miR-488 mimic组细胞用胰蛋白酶消化后调整为细胞浓度为5×105个/ml，取100 μl细胞悬液接种于BALB/c裸鼠右腋窝，建立实体肿瘤模型。2 w后通过颈椎脱位法处死裸鼠，取肿瘤组织称重。

1.10免疫组化 取各组裸鼠肿瘤组织石蜡切片，按照试剂盒说明书进行免疫组化染色，采用二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒显色，苏木素复燃，盐酸酒精分色，在光学显微镜下观察CD44的表达情况，随机选取5个不同视野，计算阳性表达率。阳性表达率=阳性细胞/细胞总数×100%。重复3个独立的实验。

1.11TUNEL染色 取各组裸鼠肿瘤组织石蜡切片，常规脱蜡至水，将切片用蛋白酶K消化，按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行染色。细胞核内出现深棕色颗粒为阳性细胞，采用光学显微镜观察并拍照，随机选取5个不同视野，计算细胞凋亡率。

1.12统计学分析 采用SPSS17.0软件进行t检验、单因素方差分析、秩和检验。

2 结 果

2.1miR-488在BEAS-2B、PC-9、H292、A549细胞中表达水平 与BEAS-2B细胞miR-488水平(1.02±0.03)比较，PC-9、H292、A549细胞均显著降低(0.53±0.01，0.47±0.02，0.26±0.03，P<0.05)，且A549细胞miR-488表达最低，因此本实验选择A549细胞进行后续实验。

2.2miR-488表达水平 与Control组和mimic-NC组(1.00±0.00，1.03±0.05)相比，miR-488 mimic组miR-488 mRNA水平显著升高(58.00±9.00，P<0.05)。

2.3转染miR-488 mimic降低A549细胞成球直径、成球率 与Control组和mimic-NC组相比，miR-488 mimic组细胞成球直径、成球率显著降低(P<0.05)。见图1，表1。

图1 细胞成球实验

表1 转染miR-488 mimic对A549细胞成球直径、成球率的影响

2.4转染miR-488 mimic下调A549细胞CD44、SOX2、OCT4蛋白表达水平 与Control组和mimic-NC组相比，miR-488 mimic组CD44、SOX2、OCT4蛋白水平均显著降低(P<0.05)。见图2,表2。

图2 Western印迹检测CD44、SOX2、OCT4蛋白表达

表2 转染miR-488 mimic对A549细胞CD44、SOX2、OCT4蛋白表达水平的影响

2.5转染miR-488 mimic促进A549细胞凋亡 与Control组和mimic-NC组细胞凋亡率〔(5.0±2.5)%、(4.8±2.2)%〕相比，miR-488 mimic组升高，差异有统计学意义〔(27.8±3.0)%，P<0.05〕。见图3。

图3 流式细胞仪检测细胞凋亡

2.6转染miR-488 mimic上调Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平 与Control组和mimic-NC组相比，miR-488 mimic组Caspase-3、Caspase-9蛋白水平显著升高(P<0.05)。见图4，表3。

图4 Western印迹检测Caspase-3、Caspase-9蛋白表达

表3 转染miR-488 mimic对A549细胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平的影响

2.7转染miR-488 mimic对肺癌裸鼠移植瘤模型的影响 与Control组相比，miR-488 mimic组肿瘤重量、CD44阳性表达率显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见图5，表4。

图5 转染miR-488 mimic对肺癌裸鼠移植瘤模型CD44阳性阳性表达率和肿瘤细胞凋亡的影响(免疫组化，×200)

表4 转染miR-488 mimic对肺癌裸鼠移植瘤模型的影响

3 讨 论

NSCLC是一种常见的恶性肿瘤，严重威胁着人们的健康和生命。寻找能早期诊断NSCLC的生物学标志物具有重要意义。miRNA是由19～25个核苷酸组成的非编码小分子单链RNA。miRNA通过细胞内复杂的信号网络，不仅参与调控细胞的多种生命活动，还在肿瘤细胞增殖、耐药等许多重要的生物学过程中发挥调控作用。miRNA的表达与多种肿瘤的预后相关，可作为肿瘤的标志物〔10〕。

肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中具有自我更新能力的细胞，其可分化成不同家族的肿瘤细胞构成整个肿瘤〔11〕。肿瘤细胞获得干细胞表型后具有较强的成球能力，并分化成其他类型的肿瘤细胞，肿瘤干细胞表型的获得是恶性肿瘤重要的生物学特性，也是肿瘤复发的重要因素之一〔12〕。研究表明NSCLC的发生发展、复发转移、抗辐射及耐药性等恶性表型特征都与NSCLC干细胞相关〔13〕。肺癌干细胞凋亡能力低于普通的肺癌细胞〔14〕。CD44、SOX2与OCT4作为NSCLC干细胞标志物，在维持干细胞多能性方面起着重要作用，其参与肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、转移、耐药、复发等过程〔15〕。刘罡等〔16〕研究发现miR-34a靶向调节CD44抑制NSCLC干细胞成球和侵袭能力。项保利等〔17〕研究发现转录因子OCT4和SOX2在NSCLC病灶内表达度高。本研究结果提示转染miR-488 mimic抑制A549细胞干样特性。

凋亡是细胞的程序化死亡，使生物体在其正常发育的过程中杀死和去除不需要的细胞，细胞凋亡紊乱是癌症发生发展的关键〔18〕。Caspase在细胞凋亡的启动和执行中起关键作用，Caspase-9是凋亡级联反应的启动子，也是线粒体凋亡途径的关键蛋白酶，Caspase-3是凋亡的主要执行者，酶切Caspase-9可进一步激活Caspase-3，Caspase-3可通过破坏细胞的完整性和裂解核酸酶使细胞凋亡〔19〕。Wei等〔7〕研究发现miR-488通过靶向高迁移率族核小体结构域(HMGN)5促进RCC细胞凋亡。Jin等〔20〕研究发现miR-448靶向Rab2B上调Caspase-3、Caspase-9表达诱导PANC-1细胞凋亡。本研究结果提示转染miR-488 mimic促进A549细胞凋亡，抑制裸鼠移植瘤生长。

综上，miR-488抑制A549细胞干样特性，促进凋亡，抑制NSCLC裸鼠移植瘤的生长，提示miR-488可成为潜在的NSCLC基因治疗靶点。