老年2型糖尿病视网膜病变外周血miR-451水平检测及其临床意义

陈王灵 劳伟 陈运信 梁晓茜 丁辉

(中山大学中山眼科中心海南眼科医院(海南省眼科医院) 海南省眼科学重点实验室，海南 海口 570311)

2型糖尿病视网膜病变是2型糖尿病患者视网膜微血管病变并发症，该病可致使患者出现视力障碍〔1〕。近年来我国2型糖尿病的发病率逐年上升，各种并发症发生人数也不断增多，据统计，在糖尿病患者中发生视网膜病变的占比高达70%以上〔2〕。糖尿病视网膜病变是一个动态演变的过程，该过程分为视网膜病变前期即非增殖期和增殖期〔3〕。而临床对于视网膜病变的程度一般都是通过相关眼科外观检查进行判定，但是对其与分期发展的机制认识尚浅。有研究表明，miR-451可以负调控糖尿病患者体内的血糖水平〔4〕，视网膜病变作为糖尿病并发症之一，其病变程度与血管内皮生长因子表达水平呈正相关〔5〕，而miR-451对血管内皮生长因子具有负调节作用〔6〕，推测miR-451的表达可能参与糖尿病视网膜病变的发生和发展，但是目前人们对于外周血miR-451是否参与老年2型糖尿病患者视网膜病变的相关认识尚浅。鉴于此，本研究对老年2型糖尿病患者的临床资料进行回顾分析，探讨上述问题，以期为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1临床资料 回顾性分析2015年8月至2019年10月中山大学中山眼科中心海南眼科医院收治的121例老年2型糖尿病者的临床资料，其中83例并发视网膜病变的患者为并发组，未并发视网膜病变的38例患者为糖尿病组；另回顾性分析同期60例在医院体检的健康者的体检资料作为对照组。其中并发组男34例，女49例，年龄60～81岁，平均(68.42±5.31)岁，2型糖尿病病程4个月至21年，平均(11.25±2.07)年，其中左眼视网膜病变21例，右眼视网膜病变23例，双眼视网膜病变39例；糖尿病组男15例，女23例，年龄60～80岁，平均(69.15±6.02)岁，2型糖尿病病程3个月至16年，平均(7.45±1.30)年；对照组男25例，女35例，年龄60～80岁，平均(69.45±6.52)岁。3组研究对象年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)，均签署本研究知情同意书。

纳入标准：①并发组和糖尿病组患者均符合2型糖尿病诊断标准〔7〕；②并发组均确诊为视网膜病变；③对照组均为体检健康者；④年龄≥60岁；⑤各组均有完整的资料信息。

排除标准：①肝肾功能异常患者；②合并其他可能影响本研究结果疾病者，如2型糖尿病肾病、白内障、青光眼等；③血液系统病变患者；④合并结缔组织及其他免疫性疾病者；⑤恶性肿瘤者；⑥合并其他糖尿病相关并发症者。

1.2方法 研究对象均采取外周静脉血4 ml(并发组及糖尿病组患者于入院当天采血，对照组于体检当天采血)，离心(转速：3 500 r/min，时间10 min)，提取血清，置于-70℃冰箱保存备测。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测研究对象外周血miR-451表达水平。用移液枪取血清加入细胞裂解液，用总RNA提取试剂盒(Invitrogen，美国)提取RNA，利用紫外分光光度计检测总RNA纯度，采用逆转录试剂盒(罗氏)将总RNA进行逆转录，以U6为内参，具体操作按照试剂盒说明书进行。PCR条件：95℃ 10 min，95℃变性10 s，60℃退火60 s，74℃延伸30 s，连续进行40次循环，每个样品均设3个平行反应孔。采用2-ΔΔCt法进行miR-451的相对定量分析。

糖尿病视网膜病变分期：参照2002年糖尿病视网膜病变国际临床分级标准〔8〕分为非增殖期、增殖期和高危增殖期，其中非增殖期包括轻度(仅有微血管瘤)、中度(微血管瘤存在且轻于重度表现)、重度(任一象限有>20处视网膜内出现或有>2个象限有静脉串珠样改变或>1个象限有显著视网膜内微血管异常)，增殖期(新生血管形成、视网膜前出血或玻璃体积血)，高危增殖期(距视盘1个视盘直径范围内有新生血管，面积>1/3视盘面积，玻璃体或视网膜前出血，伴有不广泛的视盘或视网膜其他部位新生血管，面积>1/2视盘面积)。

1.3观察指标 (1)对比3组外周血miR-451的表达水平；(2)对比并发组不同糖尿病视网膜病变分期者外周血miR-451的表达水平；(3)分析外周血miR-451的表达水平对2型糖尿病视网膜病变的诊断效能。

1.4统计学分析 采用SPSS26.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验、独立样本t检验；以受试者工作特征(ROC)曲线分析外周血miR-451的表达水平对2型糖尿病视网膜病变的诊断价值。

2 结 果

2.13组miR-451表达水平 并发组外周血miR-451表达水平(15.52±2.71)低于糖尿病组(29.25±5.89)和对照组(37.08±6.45，P<0.05)，糖尿病组外周血miR-451表达水平低于对照组，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2并发组不同视网膜病变分期患者外周血miR-451表达水平 增殖期视网膜病变患者(30例)外周血miR-451表达水平(6.70±1.85)低于高危增殖期(15.26±2.18，12例)和非增殖期视(22.05±6.17，41例)网膜病变患者，高危增殖期视网膜病变患者低于非增殖期视网膜病变患者，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3外周血miR-451表达水平对2型糖尿病视网膜病变的诊断效能 以不同的miR-451表达水平值诊断2型糖尿病视网膜病变最佳截断点为21.03，灵敏度为100.00%，特异度为92.11%，ROC曲线下面积为0.985，95%CI：0.944～0.998。见图1。

图1 外周血miR-451表达水平对2型糖尿病视网膜病变的诊断ROC曲线

3 讨 论

目前，临床尚未完全明确糖尿病视网膜病变的发病机制，相关研究学者认为该病与微血管病变、新生和内皮细胞出现损伤和增殖有关〔9〕。所以糖尿病患者做好视力检查，对于发生视网膜病变的诊断和评估至关重要。目前临床上常用裂隙灯下眼底检查、眼底荧光血管造影(FFA)判断2型糖尿病视网膜病变的发生情况和分期，虽然快速、精确，但难以了解该病的发生和发展机制。

本研究结果提示糖尿病者及并发视网膜病变患者外周血miR-451表达水平下降；外周血miR-451表达水平下降可能与视网膜病变的分期有关。miR-451定位于人类基因组中17q11.2，是miRNAs的重要成员，在2型糖尿病视网膜病变中血管的变化与血-视网膜屏障毛细血管的细胞损伤和病理变化过程中多种miRNAs均有参与〔10〕。miRNAs是一类非编码的单链RNA，在转录水平和转录后水平通过干扰mRNA碱基互补配对方式负性调控表达，参与多种疾病的发生、发展过程〔11〕。新生血管的形成使糖尿病视网膜病变的一个重要的病理改变，且miRNAs与之紧密相关，在内皮细胞、血管周细胞等多种信号通路传导中miRNAs均处于关键地位，可参与视网膜细胞的增殖、凋亡调控及视网膜病变相关的新血管形成，在2型糖尿病视网膜病变中有至关重要的作用。而miR-451对血管内皮生长因子呈现负性调控，当miR-451表达水平降低时，可导致血管内皮生长因子升高〔12〕，进一步促使视网膜色素上皮细胞进行增殖，导致视网膜病变并加重其病变程度。有动物实验研究表明，糖尿病小鼠体内miR-451表达水平低于正常小鼠〔13〕，研究结果与本研究保持一致。另有研究表明〔14〕，升高miR-451的表达量可显著减少视网膜新生血管形成，减轻视网膜病变程度。结合本研究结果和上述分析，推测miR-451表达下降可能是2型糖尿病视网膜病变发生和发展的重要因素。

此外，本研究采用ROC曲线分析外周血miR-451表达水平对老年2型糖尿病视网膜病变的诊断效能，发现其效能良好。分析其中原因可能为：糖尿病视网膜病变患者外周血miR-451表达水平过低，可增加血管内皮生长因子表达量升高，导致视网膜细胞的增殖、凋亡紊乱，促进视网膜病变相关的新血管形成，同时还可改变视网膜血管通透性，参与2型糖尿病视网膜病变的发生与发展。

综上所述，老年2型糖尿病视网膜病变患者外周血miR-451表达水平低于单纯糖尿病者和健康者，且与视网膜病变分期有关，外周血miR-451表达水平对糖尿病视网膜病变具有较好的诊断效能，可以应用于临床。根据本研究推测外周血miR-451低表达可能参与2型糖尿病视网膜病变的发生和发展，但其具体的作用机制仍需要深入研究，可作为后期探讨的重点。