大鼠脊髓损伤致痉挛后五羟色胺1D受体的表达

孟鑫 张向 张超 田焕娜 许倩 魏炜 任立群

(承德医学院河北省神经损伤与修复重点实验室，河北 承德 067000)

痉挛是脊髓损伤(SCI)后的一种常见并发症，是以速度依赖的紧张性牵张反射(肌张力)增强伴腱反射亢进为特征的运动功能障碍〔1〕。痉挛会引发许多问题，严重或长期痉挛时，会出现肌肉纤维化、疼痛、关节僵硬、甚至挛缩等，影响患者的功能恢复和生活质量，加重护理负担，是亟待解决的医学难题〔2〕。

痉挛的机制十分复杂，尚不明确，5-羟色胺(HT)及其受体数量和活性的改变，会导致不同程度的运动功能障碍，对SCI后痉挛的发病机制有重要作用〔3〕。有研究表明，脊髓中5-HT等神经传递对感觉、运动和自主功能的调节至关重要，并通过激活其受体产生不同的生理功能〔4，5〕。5-HT受体主要包括5-HT1-5-HT7受体家族，5-羟色胺1D受体(HT1DR)是5-HT1受体家族中受体亚型，并有研究表明，5-HT1DR是γ运动神经元的标志物，能够在正在脊髓运动回路中对准确接收和传递感觉信息起重要作用〔6,7〕。但SCI后，5-HT1DR的变化与5-HT1DR如何介导脊髓运动和感觉功能、是否与痉挛相关尚不明确。本研究旨在揭示5-HT1DR在SCI致痉挛后的变化。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 36只SPF级Wistar雄性大鼠，体质量(200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司〔SCXK(京)2016-0011〕。于承德医学院实验动物中心〔SCXK(冀)2017-001〕适应性饲养1 w后，将大鼠随机分为Sham组18只和SCI组18只，每组随机再分为3个亚组各6只，分别用于免疫荧光染色、Western印迹和实时荧光定量PCR实验。

1.2主要试剂 β-Actin小鼠单克隆抗体(cell signaling technology，美国)，5-HT1DR小鼠单克隆抗体(又名SR-1D抗体，Santa Cruz，美国)，Alexa Fluor 594 标记驴抗小鼠IgG(Invitrogen，美国)，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(中杉金桥，中国)，4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Abcam，英国)，RNA 提取试剂盒、cDNA和PCR扩增试剂盒(TaKaRa，日本)。

1.3动物模型制备 大鼠脊髓S2全横断SCI组模型制备方法是依据Lucas-Osma等〔8〕和Bennett等〔9,10〕广泛应用的造膜方法进行，具体如下：通过持续吸入异氟烷(2.0%～2.5%)麻醉大鼠，全身麻醉后俯卧位固定大鼠、无菌条件下操作，定位于L2椎体(L2椎体对应脊髓S2节段)，打开皮肤层及皮下组织层，于手术显微镜下操作，使用手术刀片分离棘突两侧肌肉，暴露L2椎体的棘突，咬骨钳咬除L2椎体，暴露S2节段脊髓，显微解剖镊剥离脊髓硬脊膜并局部应用0.1～0.3 ml的利多卡因(1%)，随后剥离脊髓蛛网膜，使用负压吸引器将脊髓吸出，横截面完全离断1～3 mm，注意要在手术解剖显微镜下仔细观察确保脊髓被完全横断，应避免损伤脊髓背部血管，最后逐层缝合肌肉层和皮肤层。Sham组：使用咬骨钳仅去除L2椎板，确保脊髓硬脊膜无损伤，再逐层缝合肌肉层和皮肤层。

1.4术后护理 脊髓S2全横断损伤后，大鼠尾部的感觉和运动功能障碍，注意鼠笼内垫料每天更换，保持鼠笼内干燥清洁，防止大鼠尾部压力性溃疡和自嗜等情况发生。

1.5脊髓损伤后60 d尾部痉挛评分 术后60 d，使用Bennett等〔9,10〕鼠尾痉挛评分法进行大鼠尾部痉挛评分，通过双盲法进行检测，具体操作：使用大鼠固定器固定大鼠身体，尾部暴露在外，自然悬空；左手轻握大鼠尾根，右手使用生理盐水浸过的湿纱布紧贴大鼠尾部从尾根到尾尖方向下滑，当右手从大鼠尾端划落，左手立即松开尾巴，重复以上完整动作刮擦3～4次，刮擦后大鼠尾部在大鼠固定器外可自由活动并悬空，此时需观察大鼠尾部运动并根据Bennett等〔9,10〕鼠尾痉挛评分0～5分的标准记录评分，结束后将大鼠取出放入垫料笼。

1.6免疫荧光染色检测5-HT1DR的表达 术后60 d，使用4%水合氯醛进行大鼠麻醉，以0.9%的生理盐水和4%的多聚甲醛进行灌注。在解剖显微镜下，观察在S2节段脊髓是否被完全横断，确定脊髓被完全横断即造膜成功，提取脊髓S2节段以下，用4%多聚甲醛后固定24 h，导入30%蔗糖24～48 h，使用滑动式冰冻切片机将脊髓连续横切为40 μm薄片。依次将10张切片放置于24孔细胞培养板一个孔中，如未及时处理将组织放入防冻液中并保存于-20℃冰箱中。每组从每孔中随机抽取一张完整切片，一组依次选12～13片用于免疫荧光染色〔11〕。

免疫荧光染色检测5-HT1DR：使用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)液体漂洗10 min；加入PBS-T(PBS液体中加入0.1%Triton)液体漂洗10 min；加入含5%驴血清的PBS-T室温封闭1 h；PBS-T液体漂洗10 min；分别加入小鼠源抗5-HT1DR(1∶100)，4℃孵育过夜。第2天PBS-T清洗4次，每次15 min；后续实验进行避光操作，Alexa Fluor 594 标记的驴抗小鼠(1∶200)孵育1 h，PBS清洗；滴加DAPI室温孵育5 min，PBS清洗后常规免疫荧光封片；阴性对照检测：组织直接在4℃孵育过夜不添加5-HT1DR抗体，其余实验步骤不变。使用荧光显微镜对所有切片观察，并拍摄图像。使用ImageJ软件，对选定脊髓灰质的DH、IMZ和VH三个区域，进行5-HT1DR免疫反应阳性光密度值的定量分析。

1.7Western印迹检测脊髓组织中5-HT1DR的表达 术后60 d，采用4%水合氯醛麻醉，提取脊髓损伤段S2以下新鲜组织放于0.9%生理盐水培养皿(放于冰上)中，去除多余的神经根和血液。制备脊髓组织样品蛋白，二喹啉甲酸(BCA)定量后储存备用。制胶、上样、电泳、转模、5%脱脂奶粉封闭过夜；β-actin 抗体(1∶1 000)，5-HT1DR 抗体(1∶200)室温孵育，3 h；山羊抗小鼠IgG(1∶3 000)室温孵育，1 h；电化学发光(ECL)法显色成像。Image J软件分析并计算出各组蛋白相对表达量。

1.8实时荧光定量PCR检测脊髓组织中5-HT1DR的表达 术后60 d，取新鲜脊髓S2节段以下，按照TaKaRa试剂盒说明书进行总RNA提取、反转录cDNA和RT-PCR仪进行PCR扩增，检测脊髓组织中5-HT1DR的mRNA表达水平。选取β-actin作为内参，所有引物设计由TaKaRa公司提供，引物序列：β-actin：正向引物GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA；反向引物GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG，150 bp；5-HT1DR：正向引物GCTGCCAAACCAGTCCCTAGAA，反向引物AATGATGGATAGGACCACCACGA，130 bp。按Q=2-ΔΔCt公式计算各组目的基因的相对表达量。

1.9统计学分析 使用GraphPad Prism5软件进行t检验。

2 结 果

2.1脊髓损伤60 d后尾部痉挛评分结果 SCI组18只大鼠均达到4～5分标准，并出现如下表现：其中有大鼠尾部肌张力高，出现S形，可持续阵挛10 min以上；有大鼠整个尾部打卷明显，尾尖部打卷最大可达到180～360°并每次可持续10 min以上，阵挛幅度和强度显著；还有大鼠尾部强烈阵挛，肌张力增高，持续10 min以上，并伴有大鼠尾部左右摆动鞭打。Sham组18只大鼠：对于刮擦大鼠尾部反应非常弱，无痉挛，肌肉活动和协调性良好，能保持尾巴直线，见图1。

图1 术后60 d大鼠尾部痉挛评分

2.25-HT1DR免疫荧光染色结果 在Sham组和SCI组脊髓中，5-HT1DR均主要在脊髓灰质的DH、IMZ和VH 3个区域中表达，且均在IMZ和VH区的表达较强，在DH区表达较弱，见图2，表1。3个区域中，5-HT1DR在SCI组脊髓中的光密度值较Sham组均降低，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表1。阴性对照结果，未检测到特殊免疫荧光染色。

A1～B1、A2～B2、A3～B3分别为脊髓灰质DH、IMZ和VH区域图2 术后60 d两组脊髓中5-HT1DR蛋白表达和分布(免疫荧光染色法A、B，×10；A1～A3、B1～B3，×20)

表1 两组脊髓内5-HT1DR免疫荧光光密度定量分析

2.3Western印迹检测5-HT1DR蛋白及mRNA表达比较 与Sham组比较，SCI组脊髓内5-HT1DR蛋白及mRNA表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3、表2。

图3 Western印迹检测5-HT1DR蛋白表达

表2 两组脊髓中5-HT1DR的蛋白及mRNA相对表达量

3 讨 论

SCI后痉挛机制存在多种假说〔3〕。有研究认为，SCI引起的痉挛与运动神经元过度兴奋有关，SCI后脊髓腹角运动神经元对5-HT敏感性增强，5-HT激活其受体产生持续性内向电流PICs(PICs)，PICs通过维持运动神经元放电产生不自主肌肉收缩抽搐(痉挛)〔12〕。D′Amico等〔12〕发现5-HT1B/D受体激活可降低单突触和多突触反射途径中的感觉传递，从而最终降低SCI后痉挛的触发。Lucas-Osma等〔8〕研究报道，5-HT1DR通过调节C纤维活性来间接抑制单突触反射，这为通过疼痛相关通路来调节SCI后痉挛开辟了新的可能性。Murray等〔13〕进行了SCI后运动神经元的PICs和痉挛相关联的5-HT受体的系统分析，发现5-HT2B和5-HT2C受体参与其中，尤其是改变5-HT2B受体的活性，为控制SCI后的痉挛提供了一种思路。综上所述的这些痉挛机制，5-HT或其受体均参与其中，对SCI后痉挛的发生也具有重要意义。

5-HT1B受体在一定程度上参与了SCI后AADC细胞发生功能改变从而影响SCI后痉挛发生的机制〔11〕。而5-HT1DR和 5-HT1B受体同为G蛋白耦联受体，结构极为相似且可能共同起作用〔6〕，因此考虑5-HT1DR可能也在一定程度上参与此痉挛机制，有待进一步研究。

在中枢神经系统中的研究显示，5-HT1DR广泛存在于大脑和脊髓中。Bonaventure等〔14〕采用定量原位杂交和受体放射自显影技术，观察到大鼠嗅结节，内嗅皮层，小脑，三叉神经中脑核，三叉神经节和脊髓第Ⅹ板层都有5-HT1DR表达。通过反转录PCR方法，进一步研究发现，在颈、胸、 腰、 骶段脊髓的背角和腹角都有5-HT1DR mRNA表达〔15〕。研究发现SCI患者痉挛常会伴发疼痛，两者会同时出现，可能存在共同的潜在机制，SCI后疼痛和痉挛的治疗可能互相有提示作用〔16〕。5-HT1DR与疼痛方面也有广泛研究，有研究表明，5-HT通过激活5-HT1DR可以减轻神经性疼痛〔17〕。通过激活位于脊髓和周围部位5-HT1B/1D受体可抑制1%甲醛溶液诱导的痛觉〔18〕。研究表明，5-HT1DR对三叉神经节内降钙素基因相关肽的表达和释放有重要的调节作用，且选择性的5-HT1DR激动剂无血管收缩作用，可能会成为更安全有限的治疗偏头痛的药物，有待研究〔19〕。

当然5-HT1DR还有在周围系统中的研究，如：近期研究发现5-HT1DR存在于肠系膜静脉中，可能有舒张血管的作用〔20〕。5-HT1B/1D受体激动剂可能有助于治疗5-HT系统受损引起的各种病理性瘙痒〔21〕。近期已有研究表明，5-HT1DR有加重肝癌进展的作用，可能是肝癌潜在的治疗靶点和判断预后的预测因子〔22〕。

本研究结果推测5-HT1DR表达降低可能与SCI后痉挛发生相关，为SCI后痉挛机制提供新的研究思路。