人参皂苷Rb1对4-羟基壬烯醛诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的影响

于越瀛 田莲姬 赵田田 金玫宏 崔仁哲 崔俊 (延边大学附属医院眼科，吉林 延吉 133000)

年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种老年退行性眼科疾病〔1〕。其发病机制尚不明确，但氧化应激反应作用于视网膜色素上皮(RPE)，促使线粒体发生损害，产生的活性氧(ROS)减少〔2,3〕。随着年龄的逐渐增长，人体内过氧化物酶的活性下降，视网膜RPE发生氧化损伤，导致AMD，可严重造成视力减退，影响日常生活质量〔4〕。因此，发挥抗氧化作用保护RPE细胞是防止AMD的有效途径。4-羟基壬烯醛(4-HNE)是一种醛类化合物，存在于细胞线粒体中，是导致线粒体功能障碍的重要物质〔5〕。氧化应激反应可引起4-HNE的积累，破坏信号通路、诱导炎症反应及产生细胞凋亡信号，也参与各种细胞的毒性反应，引起氧化应激相关疾病的发生发展〔6,7〕。人参皂苷Rb1(Rb1)不仅对心血管系统、中枢神经系统、免疫系统等多个系统有保护作用〔8〕，而且具有促进骨骼形成、增强免疫力、抗皮肤衰老、消除氧自由基等多种作用〔9〕。目前人参皂苷Rb1是否对RPE细胞氧化损伤具有保护作用及相关的机制尚不清楚。本研究采用4-HNE损伤RPE细胞建立体外氧化损伤模型，分析人参皂苷Rb1对RPE细胞氧化损伤的保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 人视网膜色素上皮细胞ARPE-19(美国ATCC公司)；人参皂苷Rb1(成都普瑞法公司)；4-HNE、二氯二氢荧光素(DCFH-DA,美国Sigma公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM/F12培养基、胎牛血清(美国HyClone公司)；CCK-8细胞活性检测试剂盒(日本Dojindo公司)；B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bax、β-actin抗体(美国CST公司)；CO2培养箱 (美国Thermo公司)；荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；酶标仪(美国BIOTEK公司)。

1.2细胞培养 将人ARPE-19细胞培养于含有10%胎牛血清、1% 100 mg/L的青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养基中，在5% CO2培养箱中培养，温度为37℃。当细胞生长融合至80%，定期更换培养基并将细胞进行传代繁殖，选取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3CCK-8法检测细胞活力 采用传代繁殖后ARPE-19细胞以每孔中含有5×103个细胞为标准接种于96孔细胞培养板中，且每孔中分别为200 μl细胞悬液，接种于加有培养液的细胞培养皿中，且培养皿1 w更换2次。细胞贴壁传代繁殖后更换为无血清培养液，将不同浓度人参皂苷Rb1溶液加入培养皿中培养24 h，其中人参皂苷Rb1浓度分别0.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L，24 h后分别在每孔中加入10 μl CCK-8溶液，将培养板放置培养箱中继续培养3 h，显微镜下观察并收集细胞。实验重复3次，采用CCK-8试剂盒检测ARPE-19细胞的存活率，选择450 nm波长，采用酶标仪测定各孔吸光度(OD)值，计算细胞增殖率。

1.4细胞分组及给药处理 选择10 μmol/L的4-HNE作为给药适宜浓度〔10〕，再根据CCK-8法筛选药物最佳浓度，选择浓度为100 μmol/L的人参皂苷Rb1作为最适宜浓度，接着将ARPE-19细胞分为对照组、Rb1处理组、4-HNE组和4-HNE+Rb1处理组。对照组：进行常规培养；Rb1处理组：加入100 μmol/L Rb1作用24 h；4-HNE组：加入10 μmol/L 4-HNE细胞作用12 h；4-HNE+Rb1处理组：100 μmol/L Rb1作用24 h，随后再加入10 μmol/L 4-HNE作用12 h。在光学显微镜下观察各组ARPE-19细胞排列、大小、形态等变化。

1.5荧光显微镜测定细胞内ROS含量 将分组处理后的细胞接种于直径为14 mm的24孔荧光酶标板中进行爬片，细胞进行良好的黏附后放置于培养箱中培养24 h，促进细胞贴壁生长，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗1 min，进行3次。采用无血清培养液稀释荧光染料DCFH-DA，稀释浓度为10 μmol/L。放置于温度为4℃的细胞培养箱中进行避光孵育10 min，孵育完成后用PBS再次洗涤3次，在荧光显微镜下采用荧光标记法检测细胞内ROS含量。

1.6Western印迹检测蛋白表达水平 收集各组细胞，加入50 μl蛋白裂解液(含PMSF)，冰上裂解30 min，在4℃离心机离心15 min，提取细胞总蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，取50 μg蛋白样品在10%～15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶上电泳，蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h后，分别加入Bax、Bcl-2、β-actin抗体4℃孵育过夜。次日，TBST洗3次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG，室温孵育1 h，TBST冲洗3次后，加入ECL化学发光显影剂，用Image J凝胶图像分析系统计算Bax和Bcl-2的相对蛋白表达。

1.7统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1人参皂苷Rb1对ARPE-19细胞活力的影响 0.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L Rb1作用于ARPE-19细胞24 h细胞增殖率分别为(100.00±0.37)%、(101.30±0.64)%、(101.36±0.28)%、(102.59±0.85)%、(103.21±0.57)%，各组细胞活力差异有统计学意义(P<0.01)。50.0、100.0 μmol/L人参皂苷Rb1处理后ARPE-19细胞活性显著提高(P<0.05)。

2.2人参皂苷Rb1对4-HNE诱导的ARPE-19细胞活力的影响 对照组、4-HNE组、4-HNE+50 μmol/L Rb1处理组、4-HNE+100 μmol/L Rb1处理组细胞活性分别为(100.00±0.72)%、(66.39±1.14)%、(84.02±0.96)%、(89.41±1.11)%，4组间细胞活性差异有统计学意义(P<0.001)。组间两两比较，4-HNE组明显低于对照组(P<0.05)；50、100 μmol/L Rb1处理组明显高于4-HNE组(P<0.05)，且100 μmol/L Rb1处理组变化更明显(P<0.05)。本研究选择后续实验中人参皂苷Rb1的作用浓度为100 μmol/L。

2.3人参皂苷Rb1对4-HNE诱导的ARPE-19细胞形态学影响 对照组细胞呈梭形、常规贴壁生长；4-HNE组细胞皱缩、数量较少、形态欠佳且细胞排列异常，部分细胞不能贴壁生长；4-HNE+Rb1处理组细胞逐渐得到缓解，形态得到改善。Rb1处理组与对照组细胞类似，无明显差异，见图1。

图1 人参皂苷Rb1对4-HNE诱导的ARPE-19细胞形态学的影响(×40)

2.4荧光显微镜下观察Rb1对各组细胞ROS生成的影响 对照组和Rb1处理组几乎没有呈现绿色高荧光，而4-HNE组相较于对照组呈现绿色高荧光信号增强；4-HNE+Rb1处理组相比较于4-HNE组呈现出绿色高荧光信号减弱，见图2。

图2 人参皂苷Rb1对4HNE诱导的ARPE-19细胞内ROS生成的影响(×40)

2.5人参皂苷Rb1对4-HNE诱导的ARPE-19细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响 对照组、4-HNE组、4-HNE+Rb1处理组Bcl-2/Bax表达(1.85±0.16、0.36±0.05、1.03±0.06)差异有统计学意义(P<0.001)。与对照组相比，4-HNE组Bcl-2/Bax表达明显下调(P<0.05)；与4-HNE组相比较，4-HNE+Rb1处理组明显上调(P<0.05)，见图3。

图3 人参皂苷Rb1对4-HNE诱导的ARPE-19细胞凋亡蛋白表达的影响

3 讨 论

随着日常人口老龄化速度的加快及人均寿命的逐渐延长，AMD成为老年人视力下降的原因之一，目前临床上对于AMD大多采用抗血管内皮生长因子(VEGF)治疗〔11〕。有研究表明，氧化应激是AMD发病原因之一〔12〕，且随着人类的年龄逐渐增长，身体内氧化应激反应越来越多，造成各器官逐渐衰老，进而加重损伤视网膜〔13〕，使视网膜光感受器受损，RPE层细胞氧化应激反应作为AMD的致病因素已得到证实〔14〕。临床上使用抗氧化剂对AMD患者的视力有改善作用〔15〕。抗氧化剂越来越受到重视，成为治疗AMD研究探讨的热点。

Rb1作为人参皂苷中含量最多的一种有效成分〔16〕，能改善衰老小鼠体内氧化应激水平〔17〕。人参皂苷Rb1也可抑制视神经RGC-5细胞氧化应激〔18〕。氧化应激可诱导RPE细胞中的ROS增多，造成视网膜功能损害〔19〕。本研究证明4-HNE可诱导ARPE-19细胞氧化损伤；人参皂苷Rb1可以清除4-HNE诱导生成的ROS，促进RPE细胞抗氧化损伤，提示人参皂苷Rb1对视网膜氧化损伤具有一定的保护作用。

研究显示RPE细胞功能受损可引起细胞凋亡，而人参皂苷Rb1具有显著的抗凋亡活性〔20,21〕。本研究结果提示人参皂苷Rb1能够抑制4-HNE诱导的细胞氧化损伤，进一步提示人参皂苷Rb1能对RPE细胞功能受损引起的细胞凋亡具有抑制作用。

综上，人参皂苷Rb1对4-HNE诱导的ARPE-19细胞氧化损伤具有保护作用，其机制可能与抑制氧化应激反应有关，为临床治疗AMD等视网膜疾病的防治提供了新的诊疗策略。