食管癌中Six1的表达及意义

李晓芳,赵 敏,肖 芳,张诗汇 (.承德医学院研究生院,河北 承德 067000；.秦皇岛市第一医院,河北 秦皇岛 066000)

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，我国食管癌的患病人数从1990 年的254 169例增加至498 410例，食管癌新发病人数从 1990 年的173 687例增加至2019年278 121例[1]。食管癌的病理分型主要分为鳞状细胞癌和腺癌，其中以鳞状细胞癌最常见。食管癌患者早期多无明显症状，晚期可表现为进行性吞咽困难。近年来，随着胃镜发展，使得食管癌早期诊断率有所提高，使患者得以早发现早治疗。食管癌治疗以手术切除为主，辅以化疗、放疗及多学科联合治疗等，但患者的5年生存率仍仅为20%～30%[2]。因此，深入研究食管癌发生、发展的分子机制，探索新的相关分子标志物，对食管癌的防治及预后具有重要意义。

Six1是同源盒基因Six家族的一员，是发育的主要调控因子，对正常组织和器官发育至关重要[3]。在胚胎发育早期，Six1在很多组织和器官，如肌肉、脑、肾脏等组织和器官广泛表达。近年来研究表明，在人类多种肿瘤中如胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌等存在Six1的异常表达，并通过增强肿瘤细胞的增殖、侵袭迁移能力等参与恶性肿瘤发展进程[4-7]。目前关于Six1在食管鳞状细胞癌中的研究较少，本研究通过检测Six1在食管鳞状细胞癌中的表达以及其与临床病理特征的关系，探讨Six1在食管癌发生发展及侵袭转移中的作用。

1 材料与方法

1.1材料：回顾性分析2016年1月～2020年10月秦皇岛市第一院病理科确诊的食管鳞状细胞癌56例，食管高级别上皮内瘤变47例，食管低级别上皮内瘤变39例，正常食管黏膜组织61例。排除标准：①其他组织学类型食管癌；②患者术前经过放疗或者化疗；③患者患有其他恶性肿瘤、重大脏器疾病或严重免疫系统疾病;④临床资料不全。Six1(C104244,工作浓度1∶150)抗体购自SIGMA公司。

1.2方法：免疫组化所有入选标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色。免疫组化采用Elivision两步法染色，切片常规脱蜡至水，EDTA(pH 8.0)抗原修复液高压修复1.5 min，0.3% H2O2封闭10 min，一抗4℃过夜，用PBS代替一抗做阴性对照，二抗室温30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色后苏木素复染，树胶封片。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.3结果判读：所有病例的HE切片及免疫组化染色结果均经科内2位以上高年资主任医师独立判读。免疫组化染色结果的判读采用双评分半定量法：染色强度无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色或棕褐色为2分；阳性细胞百分比<5%时，记为0分；阳性细胞百分比为5%～25%时，记为1分；阳性细胞百分比为25%～50%时，记为2分，阳性细胞百分比为50%～75%时，记为3分；当阳性细胞百分比>75%时，记为4分。当染色强度评分×阳性细胞百分比评分≥5分时，为免疫反应(+)，否则为(-)。

1.4统计学分析：采用SPSS25.0软件进行统计分析，两个/多个样本率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Six1的表达：Six1表达于细胞核，正常食管黏膜组织中基底细胞阳性。上皮内瘤变组织中基底层至全层Six1散在阳性。食管癌组织中，Six1在肿瘤细胞中弥漫强阳性表达。正常食管黏膜(15/61)阳性、低级别上皮内瘤变(23/39)阳性、高级别上皮内瘤变(36/47)阳性、食管癌(44/56)阳性。食管癌组织中Six1阳性表达率显著高于正常食管黏膜及上皮内瘤变组织(P<0.05)。见图1～4,表1。且从正常黏膜到癌组织，阳性表达率逐渐升高。

2.2食管癌中Six1的表达与临床病理特征的关系：食管癌中Sxi1的表达与患者性别、年龄、肿物最大径无关，差异无统计学意义(P>0.05)，与分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移相关，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

图1 正常食管黏膜组织中基底细胞Six1阳性(×100)

图2 低级别上皮内瘤变组织中上皮层Six1散在阳性(×100)

图3 低级别上皮内瘤变组织中上皮层Six1散在阳性(×40)

图4 食管癌组织中Six1弥漫强阳性(×100)

表1 Six1在不同食管组织中的表达(n)

表2 食管癌中Six1表达与其临床病理特征的关系(n)

3 讨论

同源盒基因Six1，属Six转录因子家族。Six蛋白最早发现于果蝇复眼，从无脊椎动物到人类高度保守。在脊椎动物中，Six家族可分为三个亚组:Six1/Siχ2(So)、Six3/Six6(Optix)和Six4/Six5(Dsix4)。Six1定位于人染色体14q23上，其Six同源结构域(HD， 60个氨基酸)和Six结构域(SD，110～115个氨基酸)高度保守[8]。Six1是发育的主要调控因子，对正常组织和器官发育至关重要，如肌肉、肾、听觉系统，感觉器官和颅面结构等。在胚胎发育早期，Six1在多种组织和器官，如肌肉、脑、肾脏等组织和器官广泛表达，待发育成熟后，Six1表达降低或消失。在胚胎发育初期，Six1丢失或表达异常，可引起各个器官的发育异常，如人鳃-耳-肾综合征(BOR)，目前普遍认为是由于Six1突变，导致EYA1-Six1-DNA复合物形成障碍所致[9]。

近年来，在人类多种肿瘤中发现Six1的异常表达，Six1在接受其上游基因调控的同时也调节其下游靶基因，参与多种通路、机制来促进肿瘤的发生及进展。曹燕飞等[10]研究发现，miR-185 可以靶向Six1基因，进而促进肺癌细胞EMT。早在2006年，Ng等[11]就发现，在肝细胞癌(HCC)组织中，Six1过表达，且其与静脉浸润、晚期病理肿瘤转移(pTNM)期和较差的总生存率相关。在其接下来的实验中，又进一步证实在HCC中，shRNA抑制Six1表达可抑制MHCC97L细胞的增殖及侵袭能力、降低F-actin聚合，并在G2/M期调控中发挥作用，从而抑制肝癌的发生和转移[12]。

本研究中提示Six1在食管癌的发生过程中起到一定作用。进一步分析食管癌组织中Six1阳性表达与食管癌的临床病理特征的关系。提示Six1参与食管癌的进展过程，且初步证明Six1与食管癌的侵袭与转移相关。本研究结果与上述Six1在其他肿瘤中的表达有相似之处，总的来说，Six1在肿瘤组织中过表达，促进肿瘤的进展。但是本研究仍存在不足，在接下来的研究中，将进一步扩大样本数，在定性的基础上进行定量实验，设计体内、体外实验，逐步深入其致癌机制的研究。

综上所述，Six1可能参与并促进食管癌的发生与进展，此后，将逐步深入探讨其相关机制，希望为食管癌的防治提供新的可能分子机制。