多黏菌素B发酵培养基研究

姜明星,随子华,周 鑫

(华北制药华胜公司,河北 石家庄 052160)

多黏菌素是由多黏芽孢杆菌产生的多种氨基酸和脂肪酸组成的环多肽类抗生素,对革兰氏阴性细菌具有强烈的杀菌作用。其作用机制是多黏菌素与脂多糖在细菌外膜结合,改变膜结构,使小分子物质泄漏从而抑制革兰氏阴性菌的生长,其对铜绿假单胞菌和许多肠杆菌科有强大的抗菌活性[1]。多黏菌素B对大多数革兰氏阴性菌有很强的抗菌作用,尤其是对绿脓杆菌效果更显著,对大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、流感杆菌、百日咳杆菌、产气杆菌和肺炎杆菌等也有很好的抗菌效果,对变形杆菌作用效果不明显[2]。经过论证:多黏菌素对生长繁殖期和静止期的细菌都有效,属窄谱抗生素[3]。临床证明:多黏菌素B与杆菌肽联合使用可以达到更好的治疗效果,多黏菌素B对患者抵抗革兰氏阴性菌有着十分重要的作用[4]。

多黏菌素B包含4个主要组分,分别是B1、B2、B3和B1-I。关于原料药中的硫酸多黏菌素B的质量要求,美国/欧洲药典有明确规定[1]:多黏菌素B1、B2、B3和B1-I总质量分数≥80%,最大单杂质量分数≤3.0%,总杂质量分数≤17%,B3质量分数≤6.0%,B1-I质量分数≤15%。世界上生产水平较高的阿尔法姆厂家,多黏菌素B的总质量分数为87%～90%。国内多家生产多黏菌素B的厂家多黏菌素B的总质量分数虽然均在80%以上,但是最大单杂质量分数极易超出药典标准。

均匀设计是一种实验点在实验范围内充分分散的实验设计方法[5],其思路是均匀分散实验点,使每个实验点有更好的代表性。笔者采用均匀设计法对多黏菌素B发酵培养基进行优化,研究培养基中添加亮氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸对组分和杂质的影响[6]。通过DPS数据处理系统[7-8]进行数据的整理与分析,得出最优氨基酸的添加方式,对减少产品最大单杂具有重大意义。该方法应用于规模化生产,为企业在国内外市场竞争中占据有利地位打下坚实的基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 出发菌株

多黏芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa),实验室-80 ℃冰箱保藏。

1.1.2 培 养 基

斜面培养基:葡萄糖10 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化钠5 g/L,牛肉膏10 g/L,酵母浸粉5 g/L,琼脂20 g/L,pH 6.8～7.0。

种子培养基:玉米淀粉80 g/L,葡萄糖10 g/L,酵母粉10 g/L,磷酸二氢钾0.15 g/L,硫酸铵4.5 g/L,轻质碳酸钙4 g/L,消沫剂0.1 mL/L,pH 6.8～7.0。

发酵培养基:玉米淀粉100 g/L,酵母粉20 g/L,磷酸二氢钾0.15 g/L,硫酸铵4.5 g/L,轻质碳酸钙0.4 g/L,消沫剂0.1 mL/L,pH 6.8～7.0。各种氨基酸首先按质量浓度40 g/L配制成溶液备用,然后根据均匀设计结果按比例加入到发酵培养基中[9]。

1.2 方 法

1.2.1 培养条件

斜面培养:用无菌吸管从冻存管中吸取孢子液,接种0.2 mL到空白斜面培养基上,于29～31 ℃培养箱内培养5 d。成熟的斜面种子于0～8 ℃保存,保存不超过30 d。

种子摇瓶培养:选取培养好的斜面,用接种铲铲取适量斜面孢子接入种子培养基中,振荡培养箱转速250 r/min,30 ℃培养27 h。

发酵摇瓶培养:摇瓶种子液培养好后,用无菌吸管按5%的体积分数接种量接入到发酵摇瓶培养基中,振荡培养箱转速250 r/min,30 ℃培养40 h。

1.2.2 发酵液效价的检测

发酵液的处理:首先取10 mL的发酵液,用纯化水稀释3～5倍,倒入离心管中,用离心机10 000 r/min离心10 min,取上清液,使用微孔滤膜过滤,然后使用HPLC检测。

HPLC检测条件:高效液相色谱仪为Agilent 1260;色谱柱采用C18硅胶柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);流动相为4.5 g无水硫酸钠溶解到900 mL的水中,用稀磷酸调节pH至2.3,用水稀释至1 000 mL制成缓冲液;以V(乙腈)∶V(缓冲液)=20∶80为流动相进行分离;流速1.0 mL/min,紫外波长215 nm,进样量20 μL,柱温30 ℃,多黏菌素B1峰的保留时间为35～40 min,运行时间约60 min。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

多黏菌素B分子由亮氨酸(L-Leu)、苯丙氨酸(D-Phe)、苏氨酸(L-Thr)、缬氨酸(D-Val)、丝氨酸(L-Ser)和异亮氨酸(L-Ile)6种氨基酸组成。取6种氨基酸分别以质量浓度1 g/L的量加入到发酵摇瓶培养基中,以不加入任何氨基酸的发酵摇瓶培养基作为对照,同时进行发酵培养[10],每组平行3个摇瓶实验,取均值,测定发酵效价,以考察不同氨基酸对多黏菌素B发酵的影响,如图1所示。

图1 不同氨基酸对发酵效价的影响

由图1可知:在对照培养基中分别加入6种氨基酸亮氨酸(L-Leu)、苯丙氨酸(D-Phe)、苏氨酸(L-Thr)、缬氨酸(D-Val)、丝氨酸(L-Ser)和异亮氨酸(L-Ile)产生多黏菌素B效价大小顺序为丝氨酸<苏氨酸<缬氨酸<对照<异亮氨酸<苯丙氨酸<亮氨酸。发酵培养基中添加苏氨酸、缬氨酸和丝氨酸,发酵效价较对照降低,3种氨基酸的添加从不同程度上抑制菌丝的次级代谢,影响了多黏菌素B的合成。当发酵培养基中添加亮氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸时,发酵效价较对照稳定或增长。3种氨基酸的添加从不同程度上提高了多黏菌素B的发酵效价,有利于菌丝的次级代谢。通过单因素实验分析,确定了亮氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸3个因素对多黏菌素B发酵效价影响为正相关,对进一步研究培养基中添加氨基酸对多黏菌素B各组分及杂质的影响具有指导意义[11]。

2.2 3种氨基酸添加量对多黏菌素B效价的影响

按照单因素实验结果确定亮氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸对多黏菌素B发酵效价影响为正相关,进一步考察3种氨基酸的添加量对多黏菌素B发酵效价的影响。将可以明显促进产物合成的亮氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸分别以质量浓度0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 g/L加入到发酵摇瓶培养基中进行摇瓶培养实验,每组平行3个摇瓶实验,取均值,测定发酵效价,以考察不同氨基酸加量对多黏菌素B发酵的影响,如图2所示。

图2 不同氨基酸添加量对发酵效价的影响

由图2可知:随着亮氨酸添加量的增加,多黏菌素B发酵效价呈负相关,因此,发酵培养基中亮氨酸添加量不宜过大,确定亮氨酸合适的质量浓度为0～1.2 g/L;随着苯丙氨酸添加量的增加,多黏菌素B发酵效价呈负相关,因此,发酵培养基中苯丙氨酸添加量不宜过大,确定苯丙氨酸合适的质量浓度为0～1.2 g/L;随着异亮氨酸添加量的增加,多黏菌素B发酵效价呈正相关,因此,发酵培养基中异亮氨酸添加量可以适当增加,确定异亮氨酸合适的质量浓度为1.0～4.0 g/L。确定了3种氨基酸的最适添加质量浓度范围,为进一步研究不同氨基酸组合对多黏菌素B组分和杂质的影响奠定了基础[12]。

2.3 均匀设计表

根据单因素实验和不同氨基酸添加量的实验结果分别确定3种氨基酸最适的质量浓度范围:亮氨酸(X1)0～1.2 g/L,苯丙氨酸(X2)0～1.2 g/L,异亮氨酸(X3)0～1.2 g/L。采用均匀设计进行3因素7水平的实验设计[13],根据DPS数据处理软件生成U7表格[14],如表1所示。

表1 均匀设计表U7(73)

均匀设计实验虽然整齐性不如正交实验,但均匀设计可以大大降低实验次数,节省人力物力,更快地得到实验结果。DPS数据处理系统可以进行数据处理和分析,建立数学模型,进行多元方差分析、回归分析、多因素分析等多类多元分析。根据DPS数据处理软件生成U7表格均匀性偏差CD=0.119 4,得到3因素7水平的实验设计表,根据该设计表进行摇瓶实验,每组实验平行做3个摇瓶。

2.4 摇瓶实验结果

以1.1.2发酵培养基为基础发酵配方,按照表1均匀设计结果添加不同比例的亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸。按照1.2.1进行摇瓶培养,采用均匀设计法以减少实验次数,依据实验方案进行发酵摇瓶实验。摇瓶培养结束后,通过HPLC检测得到发酵效价,按照质量分数计算得出各组分及杂质的效价,如表2所示。

表2 U7(73)摇瓶实验结果

由表2数据可知:摇瓶培养基中添加不同比例的亮氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸,通过HPLC检测有效成分B1、B2,主要杂质B3、B1-I、B2后(未知杂质)和B1后(未知杂质)的效价均有很大不同。对实验数据应用DPS数据处理软件进行二次多项式逐步回归分析,获得回归方程进行数据分析。

2.5 数据分析与讨论

对表2实验结果采用DPS数据处理系统进行多元回归分析[15-16],根据不同氨基酸组合与多黏菌素B各组分及杂质质量分数效价的关系,得到各组分及杂质与氨基酸组合的回归方程。

关于B2后杂质质量分数的回归方程为

Y=15.4+359.5X1+974.9X2-3 848.7X12-8 720.9X22+1 886.8X2X3

(1)

由式(1)可得3种氨基酸的添加比例与B2后杂质质量分数的关系。当B2后杂质质量分数最小时,最优添加比例为亮氨酸0 g/L、苯丙氨酸0 g/L、异亮氨酸2.6 g/L;最优实验得到最小B2后杂质效价为15 U/mL,质量分数为0.3%。

关于B1后杂质质量分数的回归方程为

Y=124.0+6 230.5X1-6 596.35X1X3

(2)

由式(2)可得:发酵培养基中添加亮氨酸会显著影响B1后杂质的质量分数,随着亮氨酸添加比例的增加,B1后杂质质量分数显著升高。不添加亮氨酸,B1后杂质的质量分数则仅由原培养基决定。最优实验得到最小B1后杂质效价为124 U/mL,质量分数为1.7%。

关于B2组分质量分数的回归方程为

Y=1 802.0-26 669.7X1+119 153.7X12+164 149.9X1X2-21 976.1X2X3

(3)

由式(3)可得:发酵培养基中添加异亮氨酸会降低B2组分质量分数;随着异亮氨酸添加比例的增加,B2组分质量分数降低越明显;苯丙氨酸具有与异亮氨酸同样的效果。

关于B1组分质量分数的回归方程为

Y=2 710.2+17 809.4X12+17 421.7X32+125 196.6X1X2-53 970.7X1X3-43 688.8X2X3

(4)

由式(4)可得:3种氨基酸的添加比例对B1组分质量分数的影响较为复杂,随着亮氨酸添加比例的增加,B1组分质量分数增加;异亮氨酸具有与亮氨酸同样的效果;随着苯丙氨酸添加比例的增加,B1组分质量分数降低。

3 结 论

多黏菌素B是一种包含有效成分B1、B2以及多个杂质B3、B1-I、B2后和B1后的多组分物质。分析了多黏菌素B的结构式,选取6种氨基酸亮氨酸(L-Leu)、苯丙氨酸(D-Phe)、苏氨酸(L-Thr)、缬氨酸(D-Val)、丝氨酸(L-Ser)和异亮氨酸(L-Ile)作为前体物质分别加入到发酵培养基中。实验发现发酵培养基中添加亮氨酸(L-Leu)、苯丙氨酸(D-Phe)和异亮氨酸(L-Ile)有利于发酵效价的提高。通过均匀设计实验研究了发酵培养基中添加不同质量浓度的氨基酸都会影响多黏菌素B的组分和杂质质量分数。亮氨酸虽然能有限地降低B2后杂质质量分数,但会显著增加B1后杂质质量分数。苯丙氨酸的增加会略微增加B2后杂质质量分数,对B1后杂质质量分数虽然基本无影响,但会显著降低B1,B2的质量分数。异亮氨酸质量浓度的增加能降低B1后杂质质量分数,微量增加B2后杂质质量分数,并且随着苯丙氨酸质量浓度的增加会显著增加B2后杂质质量分数。通过分析实验数据可知发酵培养基中添加氨基酸对多黏菌素B各组分及杂质质量分数的调节具有重要意义,研究为企业规模化、工业化生产提供数据支撑。