利用赤霉素生产菌渣制备生物乙醇

樊 逸,虞旭昶,张烨涛,谢炜煜,瞿钟情,王远山

(浙江工业大学 生物工程学院,浙江 杭州 310014)

我国是微生物发酵大国,每年都会产生大量菌渣[1]。这些菌渣成分复杂,含有多种氨基酸、大量粗蛋白、粗脂肪、抗生素及部分代谢中间产物和微量元素等,直接填埋或焚烧不仅会对环境产生威胁,直接或间接地对人类生活造成不良影响,也会造成资源浪费。赤霉素(Gibberellic acid,GA)是一种非常重要的植物生长调节剂,被广泛应用于农业生产和啤酒发酵等领域,主要通过藤仓赤霉菌(Gibberellafujikuroi)发酵生产[2]。全球超过90%的赤霉素原药GA3由我国生产[3],因此,每年产生大量的赤霉素菌渣,其处理存在一定难度[4]。从生物质的资源化利用角度考虑,这些菌渣由于含有大量碳源、氮源,通过部分代替原培养基的成分,可以极大地降低生产成本,并有利于可持续发展。

水热液化技术是一种常用的生物质预处理技术,是近年来的研究热点之一[5]。在水热液化条件下,各种原本有生物活性的小分子化合物(如抗生素等)也可能失活,采用水热液化法处理抗生素菌渣等危险固体废弃物,不仅可以降低其危害性,而且可以将水解液回用于原菌种的培养。作为水热液化的副产物之一,水相产物虽然含有大量可以供微生物生长的碳源和氮源[6],但其具有毒性,可以抑制微生物的生长[7]。目前关于水热液化水相的大量研究集中在如何对水相进行脱毒排放[8],将水相产物作为培养基的研究较少。为开发新的赤霉素菌渣处理技术,笔者首次将利用水热液化技术处理赤霉素菌渣的水解液作为培养基,用于生产生物乙醇。同时,钱江生物化学股份有限公司也在尝试利用笔者研究所得赤霉素菌渣水解液培养赤霉素产生菌Fusariumfujikuroi。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种和菌渣

高酒酵母(SaccharomycescerevisiaeCCTCC M94055),安琪酵母股份有限公司提供;赤霉素生产菌渣(主要成分为赤霉素产生菌Fusariumfujikuroi的菌丝体),浙江钱江生物化学股份有限公司提供。

1.1.2 YPD培养基

YPD培养基[9]:酵母粉,1%;蛋白胨,2%;葡萄糖,2%;pH自然。

1.2 仪器与设备

GY-3型搅拌水热反应釜,海安至精石油仪器厂;MQ-3乙醇检测模块,优信电子科技;SpectraMax M5酶标仪,美国Molecular Devices;Spectrumlab S23A分光光度计,上海棱光技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌渣水解液的制备

将新鲜赤霉素生产菌渣平铺于塑料筐,在烘箱中烘干至质量不变后,用粉碎机研磨成粉末,保存备用。

研究所用的水热反应釜为间歇式反应釜,其加热套的保温性能较好,不能实现短时间的温度控制。由于设备的限制,水热反应保温时间30 min,m(菌渣粉末)∶V(水)=1∶10(其中质量单位为g,体积单位为mL,简称固液比),搅拌速度为200 r/min,压力为水在该温度下的蒸汽压。

1.3.2 菌体生物量测定

将菌液摇匀后,吸取200 μL于96孔板中,在600 nm处用酶标仪检测光密度值(OD600)。与菌体生物量测定相关的实验均设计了1个对照和3个平行,实际值为实验组数值减去对照组得到,以OD600表示。

1.4 MQ-3乙醇传感器的设计和使用

MQ-3是一种金属氧化物半导体气敏元件,空气中乙醇的体积分数可以影响其电阻值。通过简单的分压电路,即可检测出相应的乙醇质量分数。该元件灵敏度高、稳定可靠、成本低[10],可作为简易乙醇传感器对发酵液进行初步判定。在封闭条件下,液体中的乙醇质量分数和气体中的乙醇体积分数呈正比例关系,并且该传感器的输出电压和气体中的乙醇体积分数呈正相关[11]。

因此,笔者选用50 mL离心管为密闭容器,利用3D打印的盖子将MQ-3乙醇气体传感器固定于离心管上,形成封闭空间,以实现乙醇质量分数的初步定量检测。

1.4.1 乙醇传感器检测方法

取1 mL菌液,10 000 r/min离心10 min,取上清500 μL于50 mL离心管中,盖紧盖子,让离心管内乙醇挥发一段时间达到气液平衡。将预热好的乙醇传感器盖在离心管上,传感器会通过串口向电脑返回数据绘制成曲线,如图1(a)所示,在短时间内即可达到最大值并保持稳定。取出传感器探头后,信号曲线迅速下降,待信号恢复到“基线水平”,即可进行下一次测量。简易乙醇传感器装置如图1(b)所示,包含单片机、液晶屏和MQ-3气体传感器,液晶屏上的“RT”代表当前信号值,“Max”代表在检测过程中的最大信号值,作为检测结果。

图1 MQ-3乙醇传感器信号曲线和装置图

1.4.2 乙醇传感器信号值和乙醇溶液真实质量分数的对应关系

为了将传感器返回的信号值转换为乙醇的真实质量分数,配制了不同质量分数的乙醇溶液,用乙醇传感器对这些乙醇溶液进行测定,来确定返回值和实际质量分数之间的关系。

使用量筒量取5 mL水加入试管中,再向试管中加入不同体积的无水乙醇。用移液枪吸取1 000 μL乙醇,使用分析天平称得其质量为0.753 g,计算得到每支试管中乙醇的质量分数,见表1。由于传感器非常灵敏,因此在8号试管的基础上以10倍为梯度对9,10号试管进行稀释。从每支试管中分别取500 μL乙醇溶液转移到50 mL离心管中,盖上盖子,让离心管内乙醇挥发一段时间达到气液平衡。将预热好的乙醇传感器盖在离心管上,记录乙醇信号值。取出传感器,待基线走平后进行下一次测量。

表1 乙醇质量分数和传感器信号值关系

利用MATLAB对传感器信号值和乙醇真实质量分数进行拟合,发现在乙醇质量分数较低时传感器信号变化幅度很大,较高时(2.9%～10.7%)则呈现出良好的线性关系(R2=0.990 8)。当总方程形式为f(x)=a×xb+c时,R2=0.991 4。该方程在较高质量分数范围内误差较小,在低质量分数范围内误差较大。由于低质量分数乙醇发酵液不是笔者的主要研究对象,为简化计算,之后的实验数据计算公式简化为

E=2.941×10-29×S10.21

(1)

式中:E为乙醇的质量分数;S为乙醇传感器返回的信号值。

2 结果与讨论

2.1 水解液的生物毒性验证

大量文献表明:水热液化的水相中含有大量小分子有机物,有显著的生物毒性,且处理温度越高,毒性越强。Nelson等[12]利用微藻水热液化水相产物作为培养基,发现需要额外添加葡萄糖酵母菌才能在水解液中生长。笔者发现在170 ℃时处理的水解液已经有令人不适的刺激性气味。为了验证生物毒性,通过观察酵母菌的生长情况,测试了水解液在130,150,170 ℃时的毒性。

在28 ℃下培养24 h后,酵母菌生长情况如图2所示,图中编号1～3的水解液添加量(体积分数)分别为0,50%,100%。在170 ℃处理时的水解液添加量为100%时,酵母菌菌体量和清水相近,无明显生长迹象,表明170 ℃可能温度过高,已经产生了大量抑制酵母菌生长的物质。在130 ℃和150 ℃的水解液中,酵母菌生长情况较好,150 ℃可能产生了少量的有毒物质,导致酵母菌生长情况较50%添加时差。

图2 温度和水解液添加量对S.cerevisiae CCTCC M94055生长的影响

2.2 水解条件初步探索

通过生物毒性验证,预计(固液比和时间根据前期工作确定)在1∶10固液比,30 min保温时间的前提下,最佳的反应温度可能在140 ℃左右。测试了130,140,150 ℃水解条件下的水解液,以50%和100%添加量作为培养基培养酵母,对照组为YPD培养基。每隔24 h测一次OD值,得到的生长曲线如图3所示。

图3 不同温度和水解液添加量的S.cerevisiae CCTCC M94055生长曲线

每一组酵母菌都可以生长,100%水解液添加量的生长情况要优于50%添加量,YPD组的生长情况明显好于其他各组。当水解液添加量为50%时,150 ℃优于140 ℃;当水解液添加量为100%时,140 ℃和150 ℃生长曲线接近,可能是150 ℃的水解液中有毒的物质抑制了酵母的生长。考虑到减少水解液的毒性、提高水解液利用率、节约能源,后续制备水解液温度选择140 ℃。结果表明:在低温条件下,菌渣水热液化的水相产物的生物毒性并不显著,可以直接作为培养基来培养酵母菌。

2.3 碳氮源添加研究

为了进一步验证水解液的利用价值,笔者设计了碳源(葡萄糖)和氮源(蛋白胨)添加实验。培养24 h后,结果如图4所示。

图4 碳源和氮源添加对S.cerevisiae CCTCC M94055生长的影响

添加碳源时,笔者研究的碳源添加量范围内,葡萄糖添加量越大,酵母菌生长情况越好。当葡萄糖添加量为20 g/L时,酵母菌生长情况几乎达到YPD培养基的水平;向水解液中添加蛋白胨时,酵母菌的生长情况并没有明显改变,可能是由于水解液中已经含有充足的氮源或碳源不足。以上结果说明水解液具有部分代替YPD培养基的潜力。

2.4 乙醇发酵研究

笔者在原有的140 ℃水解液水相的基础上,分别以0,50,100,150,200,250 g/L的添加量向水相中添加葡萄糖。参照文献[13]的方法,试管装液量为5 mL,接种量为5%(250 μL),在30 ℃下培养约24 h后,取1 000 μL,10 000 r/min离心10 min。取上清,通过乙醇传感器测定乙醇对应质量分数,结果如图5所示。

图5 葡萄糖添加量对S.cerevisiae CCTCC M94055乙醇产量的影响

笔者发现:当向培养基中添加300 g/L的葡萄糖时,葡萄糖并不能完全溶解,其溶解度约为275 g/L;添加250 g/L葡萄糖时,乙醇产量出现下降趋势,其原因可能是由于此时的培养基已经接近饱和,较大的渗透压抑制了酵母的生长[14];添加200 g/L左右葡萄糖时,乙醇产量达到最大,表明利用水解液取代氮源来生产生物乙醇是可行的。

2.5 乙醇发酵曲线测定

为了探究该培养基生成乙醇的最佳时间,选用200 g/L的葡萄糖添加量,分装到5组试管中,每组3个平行,装液量2 mL,接种量选用5%(100 μL)。接种后,每隔12 h左右取出1组试管(3支),吸取1 mL离心收集菌体,并测定上清中的乙醇质量分数,结果如图6所示。

图6 乙醇质量分数和S.cerevisiae CCTCC M94055生物量变化曲线

由图6可知:乙醇质量分数在达到峰值前持续稳定升高,约36 h达到最大值。乙醇质量分数达到最大值后,可能由于底物质量分数过低,产生的乙醇被酵母菌代谢[15],乙醇产量下降。从酵母菌干质量变化曲线看,前24 h酵母菌生物量增速较快,后趋于平稳,约36 h达到最大值8.3 g/L。本研究添加了约20%的葡萄糖,得到了约5.3%的乙醇产出,可能由于水解液成分复杂,对S.cerevisiaeCCTCC M94055乙醇生物合成产生了抑制。后续可以通过耐受水解液菌种筛选及其乙醇发酵工艺优化,进一步提高水解液利用率和乙醇产量。

3 结 论

我国是微生物药物生产大国,在生产过程中会产生大量菌渣,对菌渣的高效处理极具挑战性。笔者利用低温水热液化技术处理赤霉素生产中产生的菌渣,所得水相产物可以作为培养基培养S.cerevisiaeCCTCC M94055,在添加适量葡萄糖后得到乙醇,同时获得酵母菌体,初步实现赤霉素菌渣的资源化利用。虽然低温水热液化下菌渣水解程度较低,但是可以通过收集反应固相产物进行多次水热液化,以提高对菌渣的利用率。本研究也为其他微生物菌渣的处理和资源化利用提供了参考。