种植窝制备时的冷却措施对周围骨组织损伤的影响

班晨方， 王佐林

（上海市牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学口腔医学院，同济大学附属口腔医院口腔种植科，上海 200072）

种植体良好的骨结合是种植修复长期稳定的保证。 目前，口腔种植领域的基础研究主要聚焦于种植体植入后的早期骨改建过程，以期提高种植体的骨结合能力[1-2]。 制备种植窝是种植修复的起始，使用微创手术的理念减小对周围骨组织的破坏，有利于早期骨组织的改建，保障种植体形成稳定的骨结合。 Eriksson 等[3]认为，超过47 ℃持续1 min 的热传导将对骨组织产生不可逆的热损伤。 热损伤将导致细胞凋亡，延迟周围骨组织的新骨生成，甚至使其无法与种植体形成骨结合[4]。

使用冷却液是降低备孔区温度的重要措施[5]，临床手术中通常使用0.9%氯化钠溶液作为冷却液，但是使用预冷（4 ℃）还是常温（20 ℃）的冷却液仍存在争议[6-8]。 此外，有学者的研究表明，骨髓间充质干细胞在轻度升温（39~41 ℃）的条件下可促进成骨分化，表现出更强的矿化能力[9-10]。因此，探究种植窝制备过程中的产热机制及冷却措施、控制备孔区的温度变化在安全范围内，均对减少周围骨组织的损伤、促进种植体周早期骨改建及骨结合具有重要意义。 先前的研究主要使用人造骨或牛股骨等长骨进行体外种植窝制备产热的探究，与常规口腔环境及骨骼类型存在区别。 本实验建立了大鼠上颌磨牙区种植窝制备模型，通过有限元热传导模型对备孔区骨组织的温度分布进行分析，探讨不同温度（4 ℃、20 ℃、40 ℃）冷却液对备孔区骨组织温度的影响和备孔区损伤情况；探究早期过程中备孔区组织的破骨细胞及成骨细胞的活跃程度，比较早期骨改建过程的差异。

1 材料和方法

1.1 实验动物和材料

1.1.1 实验动物 SPF 级4 周龄雄性SD 大鼠48 只，体质量（100±10） g，饲养于同济大学附属口腔医院实验动物中心。 将大鼠编号后随机分为3 组，根据术中使用0.9%氯化钠溶液的温度分别命名为4 ℃组、20 ℃组、40 ℃组。

1.1.2 实验设备 牙科种植机MD20 （NOUVAG 公司，瑞士）；K 型电热偶（优利德公司，中国）； UT321测温仪（优利德公司，中国）；恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司，中国）；种植钻针（直径1.6 mm；上海岭之崎精密工具技术有限公司， 中国）; mirco-CT 机（Scanco 公司，瑞士）；NanoDrop 超微量紫外-可见光分光光度计（Thermo Fisher 公司，美国）。

1.1.3 软件 有限元分析软件ANSYS 19.2（ANSYS公司，美国）；统计学软件SPSS 17.0（IBM 公司，美国）。

1.1.4 试剂 包埋石蜡（莱卡公司，德国）；RNA 提取试剂盒Rneasy Mini Kit （Qiagen 公司， 德国）；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒（Roche 公司， 瑞士）；Runx2-ab192256 抗体（Abcam公司，英国）；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI；Thermo Fisher 公司,美国）；TRAP 染色试剂盒（Sigma 公司， 美国）； 荧光二抗（Abcam 公司，英国）；甲基绿染液（生工公司，中国）；0.9%氯化钠溶液（中国医药集团有限公司，中国）。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠建模 将4 周龄大鼠随机分为4 ℃、20 ℃、40 ℃3 种冷却液组，用3%戊巴比妥钠（10 mL/g）腹腔注射麻醉后，拔除大鼠双侧上颌第一磨牙，愈合4 周后，进行动物体内实验建模。 大鼠术前12 h 禁食，不禁水，使用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉（0.1 mL/100 g），将大鼠仰卧位固定于大鼠操作台，术区用碘伏消毒，于双侧上颌第一磨牙区切开翻瓣后，使用球钻进行种植位点定位，随后于种植位点近中相距1.8 mm 处使用手用钻制备垂直牙槽骨直径0.35 mm、深2 mm 的测温孔， 插入K 型热电偶传感器后并使用骨蜡密封和固定。使用钻针直径为1.6 mm 的种植机于定位点进行种植窝洞预备，种植机参数设定为1 000 r/min，扭矩为35 N/cm，冷却液流速为10 mL/min，制备时间为20 s。将术中的3 组0.9%氯化钠冷却液分别放置于在4 ℃、20 ℃、40 ℃水浴锅中保持温度恒定。术中使用K 型热电偶实时记录测温孔的温度变化。 手术完成后，压迫止血，使用6-0 外科缝线缝合创口，术后进食软食3 d。

1.2.2 RNA 提取和相关基因表达测定 常规处死大鼠，剥离软组织后取双侧上颌骨，将其裁剪为种植窝周围6 mm×6 mm×2 mm 大小的骨块，使用4 ℃1×PBS 溶液冲洗3 次，放入研钵中加入液氮充分冷却后研磨为粉末， 在每100 mg 骨粉加入1 mL TRIzol试剂裂解后，使用RNA 提取试剂盒提取RNA，使用超微量紫外-可见光分光光度计测量RNA 浓度及纯度后，使用逆转录试剂盒合成获得cDNA，荧光定量PCR 仪检测相关基因表达水平， 所用引物序列见表1。

表1 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)引物序列Table 1 Real-time quantitative polymerase chain reaction (RTqPCR) primer sequence

1.2.3 有限元分析 使用ANSYS APDL 软件内置的Plane 55 号单元，模拟种植窝周围纵切面骨块的二维模型。 建立高度和宽度分别为2、1 mm 的区域，划分为0.01 mm×0.01 mm 的网格， 设定钻头给进速度为0.1 mm/s，20 s 后热载荷失效。 求解后获得温度分布场，所用材料参数：骨组织热导率为0.6 W/（m·K）；骨密度为1 800/（kg·m-3）；骨比热为1 260 J/（kg·K）[11]。

1.2.4 石蜡切片及免疫荧光 用4%多聚甲醛灌流固定待取材大鼠，剥离软组织后取上颌骨，使用4%多聚甲醛溶液4 ℃下固定24 h 组织脱钙处理，组织脱水，石蜡包埋，石蜡切片机制作厚度为3 μm 连续的石蜡切片。 脱蜡完成后进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、TUNEL 染色及Runx2 免疫荧光染色，在显微镜下观察，相同放大倍率随机视野下记录阳性细胞数量。

2 结果

2.1 备孔区有限元热传导模型结果

建立有限元热传导模型后，根据3 组冷却液温度（4 ℃、20 ℃、40 ℃）进行求解计算后获得对应的备孔区温度场分布情况，选取距离种植窝洞壁1 mm、深2 mm 处的温度与该组对应的热电偶实测温度进行对比（表2），证明所设计的有限元模型拟合度较好，能匹配3 种冷却水温下的温度变化。

表2 大鼠体内实验测温孔温度变化测量值与有限元模型模拟值对比Table 2 Comparison of the temperature change in thermometric holes in vivo and the simulated values of the finite element model

获取3 组温度变化最大时，备孔区温度分布情况（图1A—C），4 ℃组和20 ℃组的备孔区骨组织温度都低于体温37 ℃，越靠近中心，冷却效果越佳；40 ℃组备孔区骨组织温度皆高于体温37 ℃， 温度最高点位于窝洞中心的钻针处， 高于40 ℃的区域约为距窝洞中央600 μm 内。 3 组窝洞中心温度随时间变化的结果见图1D，4 ℃组冷却效果最佳， 且冷却速度最快，最低可降至16.1 ℃；20 ℃组冷却效果弱于4 ℃组， 最低可降至26.9 ℃；40℃组全程高于37 ℃，并在17~20 s 时超过42 ℃，最高温度达42.9 ℃。

2.2 备孔区周围骨组织损伤情况

细胞在热损伤的情况下会产生凋亡现象，通过对术后组织凋亡情况的观察可以比较不同冷却温度下的组织损伤情况。 术后1 d， 组织细胞凋亡TUNEL 染色结果（图2A—I）显示，3 组的细胞凋亡主要分布于靠近窝洞中央的区域，40 ℃组的凋亡细胞分布范围较其余2 组广泛； 凋亡细胞计数结果（图2J）显示，40 ℃组骨组织损伤最为严重，凋亡细胞数量最多（P＜0.05）；结合有限元温度分布情况（图1A—C）， 细胞凋亡分布与高温区域分布一致。当组织得到充分冷却后，备孔区最高温度皆在热损伤温度阈值以下， 如20 ℃组和4 ℃组，2 组备孔区细胞损伤情况差异无统计学意义（P＞0.05，图2J）。术后1 d 的RT-qPCR 结果（图2K）显示，3 组Hsp70的转录水平未见明显差异（P＞0.05，图2K）。

图1 有限元模拟3 组备孔区温度分布情况Figure 1 Finite simulation of temperature distribution in three groups of socket preparation areas

图2 备孔区周围骨组织的细胞凋亡结果(×100)Figure 2 Cell apoptosis results of the bone tissue around the socket preparation area (×100)

2.3 种植窝周围骨组织形态学变化

TRAP 染色比较3 组早期骨改建过程中破骨细胞的活跃情况（图3A—I）。 术后4 d 的TRAP 染色结果（图3A、D、G）显示，40 ℃组破骨细胞激活数量多于其余2 组（P＜0.05，图3J），且分布范围大于其余2 组；术后7 d 的结果（图3B、E、H）显示,备孔区破骨细胞激活数量和范围都减弱，3 组破骨细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05）；术后14 d 的破骨细胞主要活跃于种植窝区域，种植窝内新生骨骨髓腔大于周围骨组织，3 组破骨细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05）。 3 组骨愈合过程中，未见软骨组织，愈合过程为骨膜下成骨。

图3 破骨细胞活跃情况(×100)Figure 3 Activity of osteoclasts (×100)

术后7 d， 备孔区Runx2 免疫荧光染色结果（图4A、C、E）显示，40 ℃组中Runx2 阳性细胞数量少于其余2 组（P＜0.05，图4G），成骨细胞激活水平最低，在备孔区损伤较大的情况下，成骨作用出现了延迟，4 ℃组与20 ℃组成骨细胞激活水平差异无统计学意义（P＞0.05）。 术后14 d 的结果（图4B、D、F）显示，3 组成骨细胞数量均继续增长，且主要分布于骨表面，4 ℃组与20 ℃组成骨作用强于40 ℃组（P＜0.05，图4G）。

图4 成骨细胞活跃情况(×100)Figure 4 Activity of osteoblasts (×100)

术后14 d mirco-CT 分析结果（图5）显示，3 组窝洞区骨密度均明显低于周围牙槽骨，牙槽嵴顶和鼻底未见皮质骨白线。4 ℃组与20 ℃的窝洞区基本愈合完整，4 ℃组的新生骨矿化程度最高，窝洞边缘界限不清晰；40 ℃组种植窝中心未完全形成骨基质，窝洞边缘轮廓清晰。 新生骨组织骨密度测定结果显示，4 ℃组高于40 ℃组（P＜0.05），但4 ℃组与20 ℃组差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

目前，主要是基于大型动物进行骨愈合及种植体研发的动物实验，其存在样本量小及时间点少的局限性。 随着对啮齿类动物如大鼠的研究深入，有学者认为其骨愈合方式与大型动物类似，并且鼠骨的物理特性与人类骨质没有本质区别[12-13]。 因此，本实验使用大鼠建立种植窝制备模型能为临床应用提供一定的证据和参考。

早期研究人员广泛使用红外测温仪对备孔区进行温度测定， 但该方法仅能测量组织表面的温度，无法获取组织内部温度。 而后，有学者将热电偶插入组织内部进行温度测量，该方法具有灵敏和稳定性好的优点，但依然存在无法获取种植钻针核心处骨组织温度的局限。因此,本实验引入有限元热传导模型， 并与热电偶实测温度进行拟合匹配分析（表2）， 该模型能动态模拟记录备孔区骨组织温度变化，可为未来种植窝制备过程中温度测量相关的研究提供参考。

种植窝洞制备完毕后，本实验通过观察早期不同时间点备孔区的组织形态学，分析3 组冷却液的备孔区骨损伤和早期骨愈合情况的差异。 本实验选取术后1 d 作为观察备孔区骨损伤的时间点， 检测备孔区凋亡细胞以评判损伤程度；术后4、7、14 d 时对备孔区进行骨改建， TRAP 为破骨细胞的标志酶， 通过TRAP 染色分析破骨细胞活跃程度。Wang 等[14]的研究表明，新生骨开始形成于术后7 d，Runx2 是成骨细胞分化过程中重要的转录因子，术后7 d 和14 d 采用Runx2 免疫荧光染色比较成骨细胞激活数量，探讨激活成骨速度的优劣；术后14 d 采用mirco-CT 对新骨的形态参数进行分析，评价3 组骨愈合情况。

术后1 d 检测Hsp70 表达水平（图2K），3 组差异无统计学意义， 结合40 ℃组的备孔区温度分布图（图1C），备孔区靠近窝洞中央区域超过42 ℃，细胞凋亡主要集中于该处， 边缘区域大部分维持在39~41 ℃。 温度能影响骨髓间充质干细胞的分化增殖[15]，超过47 ℃时将导致细胞凋亡[3]，但在小幅度的升温（39~41℃）环境下，持续1 h 能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[9-10,16-17]。 本实验引入40 ℃0.9%氯化钠溶液拟探究短时间（20 s）小幅度升温是否可以在大鼠上颌种植窝制备模型过程中刺激成骨细胞分化，加速早期成骨。 热应激下机体会产生热休克蛋白，其为一组高度保守且广泛表达的蛋白质，涉及细胞内蛋白质的折叠、组装和运输等过程，Hsp70 是热休克蛋白最重要的成员之一，其可以激活ERK 和Wnt/β-catenin 信号通路促进成骨[18]。 因此，本实验认为，制备过程中的短时间（20 s）无法激活Hsp70 以加强成骨作用； 术后1 d，40 ℃组的细胞凋亡数量高于其余2 组（图2J），升温超过42 ℃将导致备孔区热损伤而发生细胞凋亡，本实验结果与Chen 等[12]得出的阈值一致。

种植窝制备过程中，产热的来源主要为钻头使骨屑剥离而形变产热和钻头与骨屑及孔壁摩擦产热[11]，机械损伤和热损伤同时导致了备孔区的细胞凋亡。 本实验采用相同转速和直径的钻针进行制备，因此，制备过程中的形变产热相同，洞壁摩擦产热量相同；使用相同的冷却液流速，保证窝洞内保留相同的骨屑量，骨屑摩擦的产热量也相同[19]，因此，3 组冷却液的冷却效果差异导致了备孔区周围骨损伤的差异。4 ℃组与20 ℃组冷却下备孔区最高温度（图1A、B） 已低于相对保守的42 ℃细胞损伤阈值[12]，此时备孔区未发生热损伤现象，故区域内的细胞凋亡是窝洞制备时机械切割的细胞损伤所导致的。 因此，在已经达到充足的冷却效果下，可以考虑采取如使用合适的转速、改进钻针设计等措施[20-21]，降低备孔区骨组织的机械损伤，进而提高种植修复的成功率。

术后的骨组织愈合过程中， 术后4 d TRAP 染色结果显示，40 ℃组的破骨细胞数量最多（P<0.05），分布范围最广，对应其备孔区损伤最严重，需要进行改建的骨组织也最多；术后7 d 和14 d 成骨诱导因子Runx2 的免疫荧光染色结果显示, 备孔区损伤较小的4 ℃组和20 ℃组表现出更高的成骨活跃水平,成骨细胞激活速度优于40 ℃组；术后14 d 备孔区mirco-CT 分析显示，4 ℃组愈合情况最佳， 窝洞区可见新生骨组织充盈完毕， 但嵴顶未见骨白线，新骨矿化程度最高，骨密度高于40 ℃组（P<0.05），但与20 ℃组差异无统计学意义（P＞0.05）。 因此，本实验认为，备孔区骨组织损伤程度较大时，早期骨愈合速度也会相应减缓；4 ℃与20 ℃0.9%氯化钠溶液冷却后的备孔区在早期骨改建过程中未见愈合速度的差异。

综上所述，本实验通过构建大鼠上颌磨牙种植窝制备模型，探究备孔区周围骨组织损伤情况及早期愈合过程，表明使用合适温度的冷却液有助于减少制备过程中的骨组织损伤；在充足流量的冷却液灌流下，4 ℃与20 ℃0.9%氯化钠溶液的冷却效果未见差异，早期骨愈合速度无差异。 上述结论可为未来手术操作提供参考。