CYP3A5 在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及作用

陈伟鸿， 熊 洁， 查 骏

（广州医科大学附属口腔医院急诊综合科，广州口腔疾病研究所，口腔医学重点实验室，广东 广州 510140）

口腔鳞状细胞癌（OSCC）常常会引起咀嚼、语言 障碍和吞咽困难，每年确诊的患者超过50 万[1]，是世界上第六大常见的癌症， 约占所有恶性肿瘤的5%[2]。 OSCC 是头颈部恶性肿瘤发病率最高的肿瘤，患者通常容易发生细胞浸润和转移。 此外，虽然目前治疗OSCC 的方法很多，包括手术切除、放疗和化疗，但经这些方法治疗后，患者预后均较差，且容易产生严重的副作用， 如面部畸形或部分功能缺失等。 因此，探索OSCC 的分子机制、寻找新的治疗靶点和诊断标志是目前函待解决的问题。

CYP3A5 是细胞色素P450 酶系（cytochrome P450 enzyme system，CYPs）3A 亚家族的主要成员，主要分布于一些肝外组织如肠壁、肾、前列腺和肺等中，其传统的生物学功能为参与内外源性物质代谢。 目前的研究表明， 细胞色素P450 参与肿瘤治疗，并与肿瘤的发生和发展密切相关[3-5]。CYP3A5 是参与内源性分子如药物、外源性致癌物质和类固醇代谢过程细胞色素P450 超家族酶的成员[6]。 早期的报道显示，CYP3A5 的异常表达与肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的进展有关，可作为治疗丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）相关HCC 及标志物的靶点[7]。 但是，CYP3A5 与OSCC 之间的关系尚未见报道。

1 材料和方法

1.1 实验试剂

CYP3A5 siRNA NC （对照组）、CYP3A5 siRNA（锐博公司，中国）；DMEM-F12 培养液、DMEM 培养液、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco 公司，美国）；TRIzol试剂（Invitrogen 公司，美国）；SYBR Premix ExTaq 试剂盒（TaKaRa 公司，日本）；Matrigel 胶（BD 公司，美国）；GenMuteTM转染试剂 （SignaGen 公司， 美国）；CCK8 试剂盒（同仁公司，日本）；BCA 蛋白测定试剂盒（Beyotime 公司，中国）；一抗、抗β-actin、IgG（Abcam 公司，英国）。

1.2 细胞株来源、临床标本及细胞培养

SCC-9、SCC-25、CAL-27 细胞为人舌鳞癌细胞株， 购买于美国模式菌种收集中心（American type culture collection，ATCC）。 HOK 细胞为正常人口腔角质细胞株，购买于Sciencell 研究实验室。OSCC 及癌旁组织来源于广州医科大学附属口腔医院，该研究已取得患者同意并签署书面知情同意书，同时通过广州医科大学附属口腔医院伦理委员会同意（批准号：KY2017015）。 经病理检查确诊为OSCC，术前均未接受过化疗、放疗及免疫治疗。

HOK 细胞用DMEM-F12 培养液 （含10%胎牛血清） 培养，SCC-9、SCC-25、CAL-27 细胞用DMEM培养液（含10%胎牛血清）于37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3 细胞转染

根据GenMuteTM转染试剂操作指南进行转染，转染前1 天， 将细胞接种于2 mL 无抗生素完全培养液的6 孔板中，每孔为1×105个，当细胞生长至密度为50%~60%时更换为完全培养液 （含抗生素和10%胎牛血清），将CYP3A5 siRNA 和CYP3A5 siRNA NC 转染于不同孔中， 用无血清及抗生素的DMEM培养液稀释CYP3A5 siRNA 和CYP3A5 siRNA NC至10 nmol/L，各取80 μL ddH2O、20 μL 5×transfection buffer、4 μL GenMuteTM至5 μL 上述无血清及抗生素的DMEM 培养液稀释液中，混匀、室温下孵育20 min 后加入不同孔板中， 再加入1 mL 完全培养液，48 h 后提RNA 检测转染后基因表达水平的改变情况，并完成增殖、迁移、侵袭等实验。

1.4 细胞增殖

收集转染CYP3A5 siRNA 及CYP3A5 siRNA NC 的细胞接种于96 孔板中， 以每孔5 000 个细胞的密度常规培养于培养箱中，分别于0、24、48、72 h 时于每孔中加入10 μL CCK8 试剂， 于培养箱中放置4 h，用酶标仪测定其在450 nm 处的吸光度值。

1.5 细胞侵袭迁移

用无血清培养液对8 g/L 的Matrigel 胶进行水化，取50 μL 包被于Transwell 小室底部，37 ℃下静置2 h， 取对数生长期转染CYP3A5 siRNA 及CYP3A5 siRNA NC 后的细胞，制成1×106个/mL 的无血清细胞悬液， 向每个铺胶的Transwell 小室中加入200 μL 细胞悬液，并在24 孔板每孔对应加入600 μL的完全培养液，然后将小室放入孔中，于培养箱培养24 h 后取出，用4%多聚甲醛固定及结晶紫染色，高倍显微镜下随机3 个视野观察细胞，计数并统计。

1.6 实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

取各组对数生长期细胞，使用TRIzol 试剂提取总RNA，采用NanoDrop 2000 进行定量，通过逆转录试剂盒将RNA 逆转录成cDNA， 使用Prime-ScriptTMRT 试剂盒进行RT-qPCR，反应条件如下：95 ℃30 s，95 ℃5 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，40 个循环。通过2-ΔΔCt法进行结果计算，所有试验重复3 次。引物及内参引物均由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成，见表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 The primer sequences of the genes used for RT-qPCR

1.7 Western blotting 检测蛋白表达水平

取转染后48 h 的细胞，加入RIPA 裂解液后提取总蛋白， 根据BCA 蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，将制备好的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE），采用Western blotting 检测CYP3A5 蛋白表达情况。

1.8 免疫组织化学

使用一抗在4 °C 下对脱蜡的OSCC 组织切片进行免疫组织化学（IHC）染色，阴性对照则将一抗替换为正常IgG，在4 °C 下过夜，随后用二抗处理载玻片并用苏木精复染，随机拍摄免疫组织化学染色后的5 组图片， 通过Image J 软件分析阳性面积并进行统计，取平均值。

1.9 统计学分析

数据均采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，数据以平均值±标准差（x±s）表示，2 组间比较采用独立样本t 检验、配对t 检验，多组间比较采用单因素方差分法，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CYP3A5 在OSCC 组织和细胞中的表达水平

RT-qPCR 结果显示，在10 例OSCC 组织（0.16±0.16）中，CYP3A5 的基因表达水平显著低于其在癌旁组织（1.04±0.16）中（图1A，P<0.001）；同时，对比HOK细胞系，SCC-9、SCC-25、CAL-27 细胞中，CYP3A5 基因同样呈现低表达水平 （图1B，P<0.01）。 CYP3A5蛋白在OSCC 组织及细胞系中均为低表达水平（图1C、D，P<0.05）。

图1 OSCC 组织及细胞系中CYP3A5 的基因及蛋白表达水平Figure 1 Genetic and protein expression levels of CYP3A5 in OSCC tissues and cell lines

2.2 CYP3A5 siRNA 的转染效率检测及细胞系筛选

RT-qPCR 结果显示， 转染CYP3A5 siRNA-1 及siRNA-2 后，SCC-9 （siRNA-1: 0.61±0.07；siRNA-2:0.69±0.12）、SCC-25 （siRNA-1: 0.53±0.08；siRNA-2:0.80±0.07）、 CAL-27 （siRNA-1: 0.53±0.19；siRNA-2:0.74±0.23）细胞中CYP3A5 基因的相对表达量均显着低于对照组（图2，P<0.05），且CYP3A5 siRNA-1转染效率高于CYP3A5 siRNA-2，证明CYP3A5 基因在OSCC 细胞系中被成功敲降， 因而选用CYP3A5 siRNA-1 于后续实验，后续实验均用CYP3A5 siRNA敲降成功的细胞系。

图2 CYP3A5 siRNA 的转染效率及细胞株筛选Figure 2 Transfection efficiency of CYP3A5 siRNA and cell line screening

2.3 抑制CYP3A5 基因表达对OSCC 细胞增殖的影响

CCK8 结果显示， 转染CYP3A5 siRNA 48、72 h后，SCC-9 （48 h: 0.73±0.05；72 h: 0.97±0.06）、SCC-25（48 h: 0.73±0.05；72 h: 1.09±0.13）、CAL-27（48 h:0.79±0.06；72 h: 1.05±0.16）细胞增殖得到明显促进（图3，P<0.05）。 因 此， 在OSCC 细 胞 系 中 抑 制CYP3A5 的表达能够明显促进细胞增殖。

图3 抑制CYP3A5 基因表达对OSCC 细胞系增殖的影响Figure 3 Effect of inhibiting of the expression of CYP3A5 gene on the proliferation of OSCC cell lines

2.4 抑制CYP3A5 基因表达对OSCC 细胞侵袭及迁移的影响

Transwell 细胞侵袭结果显示， 与对照组相比，转染CYP3A5 siRNA 的SCC-9 （1 051.33±99.14）、SCC-25（1 051.67±145.75）、CAL-27（973.33±181.36）细胞穿过人工基底膜的细胞数明显增多，细胞侵袭能力明显增强（图4，P＜0.05）。 同样，Transwell 细胞迁移结果显示，与对照组相比，转染CYP3A5 siRNA的SCC-9（10 522±91.43）、SCC-25（1 070.33±116.63）、CAL-27（1 007±103.12）细胞穿过人工基底膜的细胞数显著增多，细胞迁移能力明显增强（图5，P＜0.05）。 因此，在OSCC 细胞系中抑制CYP3A5 基因的表达能够明显促进细胞侵袭及迁移能力。

图4 抑制CYP3A5 基因的表达促进OSCC 细胞侵袭(×40)Figure 4 Inhibition of the expression of CYP3A5 gene promoted the invasion of OSCC cell lines（×40）

图5 抑制CYP3A5 的表达促进OSCC 细胞迁移(×40)Figure 5 Inhibiting of the expression of CYP3A5 gene promoted the migration of OSCC cell lines（×40）

2.5 CYP3A5 在OSCC 组织中的表达水平

应用免疫组织化学法分析OSCC 组织中CYP3A5 的表达水平，结果显示CYP3A5 在OSCC 癌组织（0.007±0.002）中呈显著低水平（图6，P＜0.01）。

图6 免疫组织化学法分析CYP3A5 在OSCC 组织中的表达水平(×40)Figure 6 IHC analysis of CYP3A5 staining expression level in OSCC tissues（×40）

3 讨论

经过不断的实践研究，人们逐渐提高了对癌症相关基因的认知，但是某些癌症的确切分子机制及致病机理仍然不清楚，如OSCC 的发生是多因素、多步骤、逐渐发展的结果[8]。 OSCC 是世界上最常见的恶性肿瘤之一。与其他恶性肿瘤类似，OSCC 的形成是多种因素导致基因突变的结果。 淋巴结局部转移是OSCC 主要的、对治疗预后影响最大的生物学行为[9]。 虽然近年来口腔癌患者的治疗效果有所改善，但近5 年的生存率没有得到明显改善，约为50%[10]。因此，深入了解OSCC 的发病机制和鉴定新的基因治疗方案是近年来的重点。

CYP3A5 是细胞色素P450 CYP3A 亚家族的主要成员之一， 它在以前的研究中侧重于药物代谢、CYP3A5 多态性与癌症风险之间的关系[11-15]。近年来， 许多研究表明，CYP3A5 在多种肿瘤中异常表达，而其异常表达与肿瘤侵袭、转移密切相关。在早期的研究中， 发现CYP3A5 在骨肉瘤患者中高表达，并与转移和预后相关，这可能会使其成为骨肉瘤的生物标志物[16]。 此外，CYP3A5 的表达水平在肝细胞癌中显著降低，并通过TORC2/Akt 信号通路抑制肝癌的侵袭和转移[42]。 与上述研究结果一致，本研究的结果表明，人OSCC 中CYP3A5 的表达降低。

综上所述， 在本研究中，CYP3A5 基因在OSCC癌组织和细胞系中均呈现低表达， 并促进OSCC 细胞系的增殖、侵袭及迁移。 本研究表明，通过抑制CYP3A5 基因表达能促进OSCC 细胞的细胞增殖、侵袭和迁移，CYP3A5 可能成为未来OSCC 潜在的生物标志物和治疗靶点， 为OSCC 的治疗和预后提供了新靶点，但其在临床中作为靶向治疗分子和生物学标志物的作用，还有待进一步的研究。