镉对鸭破骨细胞焦亡的影响

王 怡，马勇刚，冉 迪，刘宗平*

(1.扬州大学 兽医学院,江苏 扬州，225009；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏 扬州 225009)

近年来，我国畜禽饲料受到不同程度的镉污染，多地抽检的饲料样品出现铅镉含量超标[1]。饲料中镉的持续污染主要以食物链的方式进入人和动物体内[2]，生物半衰期可达10～30年，主要蓄积在肝、肾和骨骼，但其对骨骼的毒性机制尚不明确。破骨细胞是一种多核的终末分化细胞，主要负责降解骨基质，在骨代谢中发挥着重要的作用[3]。研究发现，破骨细胞功能抑制是镉诱导骨质疏松的主要原因[4]。

研究发现，细胞凋亡在镉诱导的鸭骨质疏松中发挥了重要作用[5]，镉暴露明显增加了鸭成骨细胞和破骨细胞的凋亡。除了细胞凋亡外，其他的细胞死亡方式是否参与镉诱导的骨质疏松？细胞焦亡是一种非典型的程序性细胞死亡方式[6]。不同于细胞凋亡，细胞焦亡会呈现一系列与炎症反应相关的形态变化和生理结果，主要表现为细胞膜的通透性改变，细胞内容物大量释放，细胞膜有大量孔道形成，最终细胞裂解死亡而引发炎症反应[7]。经典的细胞焦亡是由活化后的炎性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1) 切割活化的GSDMD所介导[8]，除此之外，活化后的Caspase-1同时也可以剪切细胞因子IL-18和IL-1β的前体使其成熟[9]。近年来的研究发现，细胞焦亡参与了很多疾病的发生与发展[10]。但镉暴露是否可以诱导破骨细胞焦亡依然尚未阐明。本研究以鸭破骨细胞为模型，通过多种方法探究镉暴露是否可以诱导鸭破骨细胞发生焦亡，为镉诱导的骨质疏松提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级鸭胚，由高邮市种鸭繁殖基地提供。

1.2 主要试剂LDH检测试剂盒 (碧云天生物技术有限公司)；IL-18和IL-1β检测试剂盒 (上海酶联生物技术有限公司)；Annexin V-FITC 细胞死亡检测试剂盒 (南京诺唯赞生物科技有限公司)；Hoechst染色液 (翌圣生物科技有限公司)；Caspase-1试剂盒 (Immunochemistry,USA)。

1.3 鸭破骨细胞分离与培养15日龄的SPF级鸭胚表面消毒，分离股骨，用不含血清的培养基冲出骨髓，过滤后离心。用含血清的培养基重悬细胞，离心后接种于培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后换新鲜培养基，如果细胞密度适宜，5 d后可见大量成熟的破骨细胞。

1.4 鸭破骨细胞形态的观察成熟的破骨细胞镉暴露12 h后，在倒置显微镜下观察破骨细胞形态变化并拍照。

1.5 ELISA试剂盒检测LDH、IL-18和IL-1β的含量鸭破骨细胞经镉处理结束后，根据试剂盒说明书检测LDH、IL-18和IL-1β的含量，根据D值计算出各自的相对含量。

1.6 Casepase-1活性和细胞焦亡的检测待细胞处理完成后，用胰酶消化细胞，收集细胞于流式管中，分别用FITC、PI和SYTOX标记细胞，用流式细胞仪检测其活性和焦亡率。

1.7 用PI和Hoechst染色观察破骨细胞膜的完整性细胞处理结束后，弃去细胞板中培养基，加入含PI和Hoechst的PBS在培养箱孵育1 h，在荧光显微镜下观察各自的荧光强度。

1.8 数据分析所有数值均使用GraphPad Prism软件分析作图,数据用“平均值±标准差”表示。P<0.05表示组间差异显著,P<0.01表示组间差异极显著。

2 结果

2.1 镉暴露对鸭破骨细胞形态的影响如图1所示，鸭骨髓单核巨噬细胞培养5 d后，可获得多核的破骨细胞，用镉处理12 h，采用倒置显微镜观察破骨细胞的形态。结果显示，对照组破骨细胞形态完整，细胞膜表面光滑，镉暴露明显改变了破骨细胞形态，主要表现为破骨细胞肿胀，具有立体感，细胞膜表面出现大量孔洞。上述结果表明，镉暴露改变了破骨细胞形态。

图1 镉对鸭破骨细胞形态的影响

2.2 镉暴露对鸭破骨细胞内LDH释放的影响如图2所示，成熟鸭破骨细胞镉处理12 h后，采用LDH试剂盒检测破骨细胞内LDH的释放。结果显示，随着镉暴露浓度的增加，LDH的释放量显著高于对照组 (P<0.05)。

与对照组相比，*P<0,05，**P<0.01。下同

2.3 镉对鸭破骨细胞焦亡率的影响如图3所示，鸭破骨细胞镉暴露12 h后，流式细胞术检测破骨细胞焦亡率。结果显示，与对照组相比，镉暴露明显增加了破骨细胞的焦亡率 (P<0.05)。

图3 镉对鸭破骨细胞焦亡的影响

2.4 镉对鸭破骨细胞Caspase-1活性的影响如图4所示，为了探讨Casepase-1是否参与镉诱导的鸭破骨细胞焦亡，流式细胞术检测了Caspase-1的活性。结果显示，与对照组相比，随着镉浓度的增加，Caspase-1的活性逐渐增加 (P<0.05)。

图4 镉对鸭破骨细胞Caspase-1活性的影响

2.5 镉对鸭破骨细胞内IL-1β和IL-18的影响图5所示，ELISA试剂盒检测破骨细胞内IL-1β和IL-18含量。结果显示，随着镉浓度的增加，与对照组相比，破骨细胞内IL-1β的含量呈剂量依赖性增加 (P<0.05)，IL-18的含量也显著增加 (P<0.05)。

图5 镉对鸭破骨细胞IL-18(左)和IL-1β(右)的影响

2.6 镉对鸭破骨细胞PI和Hoechst染色的影响如图6所示，采用PI和Hoechst染色观察破骨细胞细胞膜和细胞核的完整性。结果显示，与对照组相比，镉暴露后红色荧光明显增强，同时蓝色荧光也显著增强。

图6 镉对鸭破骨细胞PI和Hoechst染色的影响

3 讨论

研究发现，镉暴露与骨质疏松等疾病有密切的关系，但是很少有研究揭示细胞焦亡在骨质疏松中的机制。本课题组前期研究证实了镉暴露诱导大鼠原代成骨细胞凋亡[11]。近年来，随着全球工农业的不断发展，重金属污染日趋严重，有关镉毒性的研究也越来越多。本研究采用鸭成熟破骨细胞暴露于镉建立细胞损伤模型，探讨镉诱导鸭破骨细胞死亡的机制，为后期进一步了解镉诱导的骨损伤提供新思路。

重金属镉是一种严重影响动物和人类健康的环境污染物，骨骼是其主要的靶器官之一。近期研究发现镉暴露促进了鸭破骨细胞的凋亡及抑制了破骨细胞的分化，表现出明显的骨质疏松[5]。细胞凋亡是不同于细胞焦亡的一种程序性死亡方式，细胞凋亡时主要表现出细胞皱缩，细胞骨架解体，细胞核浓缩等。细胞凋亡涉及一系列基因的调控，病理和生理条件下均可发生[12-13]。本研究结果显示，镉暴露可使鸭破骨细胞肿胀、具有立体感以及空洞的形成，最终诱导破骨细胞死亡。该种死亡方式明显不同于细胞凋亡，但完全符合细胞焦亡的形态特征。因此，破骨细胞焦亡很可能是镉诱导其死亡的主要途径。

除此之外，细胞凋亡和焦亡都是由Casepase家族介导，细胞焦亡主要是由Caspase-1和Caspase-3介导[14]，细胞凋亡主要是Caspase-8和Caspase-9介导的[15]。Casepase-1是属于Caspase家族的成员，其激活主要依赖于炎性小体的组装。当外源性的刺激激活炎性小体后，可直接招募Caspase-1，使其发生自剪切激活[16]。激活后的Casepase-1可诱导细胞发生焦亡，同时可剪切细胞因子IL-18和IL-1β的前体使其成熟，Caspase-3是不依赖炎性小体而参与调控细胞焦亡。本研究发现，镉暴露后，Casepase-1的活性明显增加，IL-18和IL-1β的产生也伴随镉浓度的增加显著升高。另外，细胞发生焦亡时细胞膜通透性增加，内容物大量释放，同时胞外的水分透过细胞膜孔道大量进入胞内，使细胞肿胀，最终细胞裂解死亡[17]。本研究发现，镉暴露后破骨细胞除了形态发生明显改变外，破骨细胞内LDH释放量显著增加，这进一步说明破骨细胞由于细胞膜破裂而发生大量死亡。结合焦亡的特征，本研究进一步验证了镉诱导鸭破骨细胞焦亡的发生。细胞凋亡时，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸外翻与FITC-AnnexinV结合，但此时由于细胞膜并未破裂，PI不能够进入细胞与DNA结合，而发生细胞焦亡时由于细胞膜破裂，PI可直接进入细胞内，形成FITC和PI双染的细胞群[18]。本研究结果表明，镉暴露明显增加了FITC和PI双染的细胞群，进一步表明镉暴露引起了鸭破骨细胞发生焦亡。PI和Hoechst染色进一步验证了镉暴露诱导鸭破骨细胞发生焦亡而不是凋亡。总之，本试验结果表明，镉暴露诱导了鸭破骨细胞发生焦亡。