基于网络药理学探讨茵陈四逆汤治疗慢加急性肝衰竭的分子机制*

肝衰竭是多种因素引起肝脏合成、解毒、代谢和生物转化功能严重障碍或失代偿的一类严重症候群，病死率极高，28 d死亡率为30%～40%。其中慢加急性肝衰竭(ACLF)是我国最常见的肝衰竭类型

。目前肝衰竭的内科治疗缺乏有效药物及手段，经积极内科综合治疗和/或人工肝治疗病情无法好转或恢复者，肝移植成为最后的治疗手段，但肝移植费用高，供肝紧缺，尚难广泛开展。中医学在我国历史悠久且沿袭至今，中药在肝衰竭的治疗中具有一定优势。茵陈四逆汤治疗ACLF确有疗效，但目前的研究大多局限于某一通路或作用靶点进行研究，无法体现中药多途径、多靶点的特点。网络药理学结合了层次网络构建与分析、生物信息学、计算生物学、多向药理学分析等多学科的研究方法和内容，将单一靶标、单一途径的研究形式转变为整体、系统的形式，以探索药物、靶点、疾病之间的关联，与中医的整体观一致

。因此本文通过网络药理学较全面研究了茵陈四逆汤治疗ACLF的作用机制，以期为后续研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 茵陈四逆汤活性成分及相关靶点筛选 从TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索茵陈四逆汤中各药物的化学成分，借助该数据库ADME(absorption and distribution and metabolism and excretion)的功能以筛选出各药物的活性成分

，设定口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18筛选活性成分,得到药物活性成分后，利用TCMSP数据库检索中“Related Targets”这一功能查找各活性成分对应作用的靶蛋白，运用Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)将蛋白质的名称进行标准化处理，并将靶蛋白转化为genesymbol，限定物种为“Homo Sapiens”，从而得到药物靶点。

1.2 ACLF相关靶点筛选 分别通过GeneCards数据库(https://www. genecards.org)、OMIM数据库(http://www.omim.org)、TTD 数据库(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)，以“acute-on-chronic liver failure”为关键词检索ACLF相关靶点，在Genecards数据库中，Score 值越高代表该靶点与疾病联系密切,选取Relevance score≥5的靶点为ACLF的潜在靶点，将3个数据库的结果进行合并，删除重复靶点，从而得到ACLF相关靶点。

1.3 茵陈四逆汤与ACLF共同靶点的获取并进行网络构建 将筛选得到的药物靶点与疾病靶点导入Draw Venn Diagram平台(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制韦恩图，并得到交集靶点，预测其可能为茵陈四逆汤治疗ACLF的靶点；将治疗靶点提交给STRING 11.0数据库(https://string-db.org)构建蛋白互作网络(PPI)

，将生物种类设定为“Homo sapiens”，设置highest confidence=0.9，并隐藏游离节点，其余设置均为默认设置，得到PPI网络。利用Cytoscape3.7.2软件进行可视化分析， 运用CytoHubba得到关键子网络，采用MCC算法计算基因核心度，选取MCC评分前10 的基因，认为其可能是茵陈四逆汤治疗ACLF的关键基因；同时利用Cytoscape3.7.2软件构建药物活性成分-靶点-疾病网络图，使用Network Analyzer功能计算出各个节点(node)的网络拓扑参数初步评估其重要性，包括连接度(Degree)、介度(Betweenness)及紧密度(Closenesss)等，每个节点的大小根据连接度大小而调节，连接度值越大，节点越大，从而得到主要药物活性成分。

1.4 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 借助Metascape数据库对134个治疗靶点进行基因本体(GO)富集分析以及基因组百科全书(KEGG)通路分析，设定阈值

<0.01,从而探讨治疗靶点参与的生物学功能以及靶点涉及的信号通路，根据

值评估蛋白列表注释功能的显著性，筛选排名靠前的生物过程或通路，并通过微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化及对KEGG结果中重要通路进行分析。

2 结果

通过PPI网络分析发现JUN、TNF、IL1B、IL6、STAT3、IL4、CXCL8、CCL2、MAPK3、RELA为网络的关键靶蛋白。JUN可被c-Jun N-末端激酶(JNK)激活，上调凋亡蛋白Bim表达而诱发线粒体途径介导的细胞凋亡

。TNF、IL1B、IL6、IL4为重要的炎症因子。STAT3是一种潜在的转录因子，Kim等

研究发现IL-6通过mTOR/STAT3信号途径刺激CD4

T淋巴细胞内的STAT3磷酸化及表达增加，促进Th17细胞产生IL-17增加，加重ACLF患者的炎症反应。

利用Cytoscape3.7.2软件构建药物-活性成分-靶点网络图，见图3。通过Cytoscape3.7.2内置的Network Analyzer分析茵陈四逆汤治疗ACLF的网络拓扑学参数，得到核心药物成分。由图可看出药物、靶点、疾病构成了复杂的网络关系，体现了茵陈四逆汤治疗ACLF不是通过单一的成分或靶点，而是通过多成分、多靶点来发挥作用。每种活性成分均能与多个靶点相互作用，每个靶点也能与多个活性成分相互作用，其中按连接度值排名前4位药物活性成分依次为槲皮素(quercetin)(DC=211,BC=0.213 842 18,CC=0.588 235 29)、异鼠李素(isorhamnetin)(DC=41,BC= 0.006 953 58,CC=0.416 666 67)、山奈酚(kaempferol)(DC=40,BC=0.035 956 1,CC= 0.444 444 44)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)(DC=36,BC= 0.010 343 94,CC= 0.409 556 31)，见表1。

7.Wish you a very special Thanksgiving Day for you and your family.

2.2 ACLF相关靶点 通过GeneCards数据库以“acute-on-chronic liver failure”检索疾病靶点，得到1 929个目标靶点，选取Relevance score≥5的靶点，得到1 116个靶点。结合OMIM数据库、TTD数据库检索“acute-on-chronic liver failure”以补充潜在靶点，将3个数据库的疾病靶点进行合并，删除重复值，得到疾病靶点1 448个。

本研究分析显示槲皮素、异鼠李素、山奈酚等为茵陈四逆汤治疗ACLF的主要活性成分。槲皮素可通过下调NF-kB、MAPK信号通路抑制IL1、IL6、IL8、TNF-α等炎症因子的表达，并参与Bcl-2/Bax信号通路防止肝细胞凋亡

；还可调节Th17/Treg细胞的平衡向Treg优势转变，减轻细胞免疫损伤，并显著降低Th17相关促炎细胞因子IL-17和IL-6的水平

。异鼠李素能通过抑制c-Jun N-末端激酶(JNK)减少细胞凋亡

。宋金玥等

发现在山奈酚干预下肝衰竭小鼠的肝组织中，IκB-α表达明显升高，磷酸化型NF-κB p65表达明显降低，小鼠肝细胞凋亡数量明显减少，猜测山奈酚通过抑制NF-κB途径，下调炎症因子，减轻肝细胞凋亡。

KEGG分析提示治疗靶点涉及169条通路，其中与ACLF相关的通路有49条，根据

值由小到大排名，将与ACLF相关的信号通路前20个绘制气泡图，其中AGEs-RAGE信号通路、Hepatitis B、IL-17信号通路、TNF信号通路、Hepatitis C、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路均居于前位，且通路中均富集较多靶点，提示这些通路可能是茵陈四逆汤治疗ACLF的重要通路。同时NF-kB信号通路、Th17细胞分化通路、Toll样受体信号通路在肝衰竭疾病发展中也起重要作用，见图4(B)。因此据图中结果提示茵陈四逆汤可能是通过抑制炎症、减少细胞凋亡、调节免疫等多途径来治疗ACLF。

然而，事实上，他们却都是没有理想、没有信仰，也没有完整的传统文化思想体系的人，到一起也不过就谈一些如何挣钱、如何享受以及卿卿我我的性爱话语。他们的一举一动，都还是为了吃好、穿好，以及感觉器官的享受而去追求、去奔波。在未来的生活长河中，何时遇急流险滩，何时遇风雨交加，他们却从来没有想过。

3 讨论

肝衰竭是一组终末期肝病症候群，在西医治疗的基础上加用中药治疗在改善其症状、生化指标，降低死亡率方面疗效确切

。虽然中医学中并无肝衰竭的病名，根据其临床表现，可归属于“急黄”“瘟黄”等范畴。《金匮要略》言“黄家之所得，从湿得之。”湿邪致病在黄疸的发病过程中早已不鲜，而阳虚在ACLF的发病过程中的作用逐渐被医家所认识。清代黄元卿认为黄疸为脾阳虚，脾土湿邪过盛所致；毛德文教授亦以扶阳培土法为原则治疗ACLF，取得显著疗效。茵陈四逆汤始载于宋·《伤寒微旨论》，由茵陈、制附子、干姜、炙甘草组成，具有温阳散寒、利湿退黄的功效，现代药理示茵陈四逆汤具有保肝利胆退黄、抗炎、增强免疫的作用

，可降低ACLF患者ALT、AST、TBil等肝功能指标、改善凝血功能及MELD评分，延长存活时间

。

2.3 网络构建及可视化分析 通过韦恩图绘制平台，将筛选后的药物靶点与疾病靶点绘制韦恩图，得到茵陈四逆汤治疗肝衰竭的靶点134个；进而将134个治疗靶点导入STRING11.0数据库，将节点之间的关联分值(Combine score)设置highest confidence=0.9，设置隐藏游离节点，其余设置均为默认设置，得到PPI网络。运用Cytoscape 3.7.2软件进行PPI可视化，其中有134个节点，138条边，平均节点度8.88(见图1)。运用CytoHubba得到关键子网络，采用MCC算法计算基因核心度，选取MCC评分前10 的基因，分别为JUN、TNF、IL1B、IL6、STAT3、IL4、CXCL8、CCL2、MAPK3、RELA，这些靶点可能为茵陈四逆汤治疗ACLF关键靶点，见图2。

2.4 GO功能及KEGG通路富集分析 利用Metascape数据库，分别从生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组分(CC)3个不同的靶点功能水平对134个靶点进行GO富集分析。由图4(A)可知，按照

<0.01的阈值过滤，茵陈四逆汤参与的生物过程主要为对脂多糖的应答、对有毒物质的反应、细胞因子介导的信号通路、对细胞外刺激的反应等；由细胞组分分析可知膜筏、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物、囊腔、细胞外基质占主要；而分子功能主要包括转录因子结合、细胞因子受体结合、蛋白激酶结合等。

2.1 茵陈四逆汤活性成分及靶点 经过检索获得236个靶点基因与经TCMSP数据库鉴定茵陈四逆汤中的131个活性成分相关联。其中茵陈中13种活性成分共作用于322个靶点，附子中65种活性成分共作用于28个靶点，干姜中148种活性成分共作用于51个靶点，甘草中92种活性成分共作用于1 488个靶点。结果表明，相同的活性成分可以作用于不同的靶点，不同的活性成分也可以作用于同一靶点。

这样崇高的境界，并非人人都能达到，但并不影响我们去做一个有益于社会的人。山东烟台孤寡老人刘盛兰，花甲之年拾荒助学，20多年积攒了10万多元，自己省吃俭用，却悉数捐给了全国各地100多个贫困学子。云南省原政协副主席杨维骏，顶着巨大压力和风险，坚持实名举报原省委书纪白恩培，为最终擒获这只恶“虎”立了功。山东老人候井天，离休后以一己之力踏破铁鞋费数年之功，编著了《聂绀弩旧体诗全编》，功德无量。他们的“夕阳”红得像朝阳一样绚丽多彩。

信贷扶贫资金管理方面主要的创新有：第一，借款主体的创新，先后尝试了直接贷款到户、扶持经济实体、支持地方主导产业和龙头企业，以及直接贷款到户与委托帮扶贷款相结合等方式；第二，贷款方式创新，1986年以来尝试了政府信用下的经济实体贷款、依托社会信用的小额贷款、抵押和担保为基础的企业或政府贷款等；第三，贴息方式创新，尝试了贴息给承贷银行、贴息给借款人等方式；第四，承贷机构选择，先后尝试了商业银行承贷、政策银行承贷、地方政府选择等方式。

茵陈四逆汤治疗ACLF的主要通路为AGEs-RAGE通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路。研究表明AGE与RAGE结合后可激活NF-κB通路，增加IL-1、IL-6和TNF-α的合成和释放

，并导致活性氧(ROS)的产生和RAGE自身的上调，ROS导致线粒体的通透性改变，诱导促凋亡因子细胞色素C的释放，促进下游Caspase-3活化，引起细胞凋亡

。同时线粒体作为TNF启动死亡信号的靶标，可通过刺激释放ROS，进一步导致细胞凋亡及坏死的发生

。研究表明，阻断RAGE可以改善线粒体损伤，减少AGEs诱导的氧化应激，减轻肝脏的炎症损伤

。HIF-1主要调节细胞对缺氧或缺血的主要反应

，低氧可引起线粒体功能障碍。慢性HIF-1激活可导致慢性炎症，并有导致纤维化、肝细胞死亡或癌症的风险

。研究发现ACLF患者肝组织中可见缺氧诱导因子HIF的表达，而在慢性乙型肝炎、肝硬化及正常肝组织中均未见其表达

。辅助性T细胞17(Th17)可分泌IL-17、IL-6和TNF-α等多种效应因子，IL-17 可通过诱导趋化因子和多种促炎细胞因子(如IL-6和TNF-α)来介导炎症反应

。而PI3K-Akt信号通路在细胞存活和抗凋亡中起重要作用的激活，参与肝脏的保护机制

。由此猜测茵陈四逆汤可能通过抑制AGEs-RAGE通路介导的线粒体损伤来发挥治疗ACLF的作用。

双卧轴混凝土搅拌机，又称为圆形槽机，是在七十年代的新型机开发的，可分为单轴和双轴搅拌机，这种形式的下跌，迫使两种搅拌功能，刀片的速度比涡速度较慢，所以耐磨性比涡型低很多。

从本研究结果可以看出茵陈四逆汤治疗ACLF是通过多靶点、多通路的复杂过程，单个或多个重要靶点即可对整个网络进行调节，其可能是通过抑制炎症反应、调节免疫、抗氧化应激途径而发挥作用，为临床运用茵陈四逆汤治疗ACLF提供依据，为发掘茵陈四逆汤的潜在机制提供新方向。但本研究存在一定局限性，未将茵陈四逆汤在煎煮后的化学成分及活性成分在体内的代谢物纳入研究。其次，本研究主要是以生物信息学与海量数据计算的结果为基础，后续将在此基础上进一步筛选进行动物或细胞实验验证，进而明确茵陈四逆汤的主要调控靶点。

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