灵芝多糖对肝纤维化小鼠肝损伤及免疫功能的保护作用及机制研究*

肝纤维化是一种可逆的动态性创伤-修复反应，若不及时干预，可持续进展为假小叶、肝结节，造成肝硬化，甚至引发肝癌

。肝纤维化损伤还可影响机体细胞免疫、体液免疫功能，引发免疫功能失调，而免疫功能异常改变可加重肝组织损伤，形成恶性循环

。因此，临床探寻肝纤维化有效逆转或控制方法，已成为研究热点之一。有研究认为肝纤维化主要是因湿、热、毒、郁、虚等因素引发肝功能损伤所致

。灵芝为我国传统中药之一，可补气安神、保肝解毒、补养气血，灵芝多糖为灵芝主要活性成分，具有保肝解毒、免疫调节、抗肿瘤、抑制血管新生等作用，且对多种有毒物质、免疫、缺血、缺氧等所致肝损伤有保护作用

。本研究分析了灵芝多糖对肝纤维化小鼠肝损伤、免疫功能的影响并探讨其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只ICR成年健康雄性小鼠，6～8周龄，体质量25～30 g，购自北京科兴生物制品有限公司(许可证号：SYXK(京)2019-0053)。适应性喂养7 d，清洁级饲养环境，温度(24±2)℃，湿度50%～65%，普通饲料、自来水喂养，自然光照。本研究经动物伦理委员会批准，动物处置符合“3R”原则。

1.2 药物、试剂和仪器 灵芝多糖(纯度，沈阳恩世制药有限公司)，无翅型MMTV整合位点家族(Wnt)/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路激活剂SKL2001(徐州天鸿化工有限公司)。天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBil)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)，苏木精-伊红(HE)试剂盒(赛默飞世尔科技公司)，兔抗小鼠Wnt1/3a/10、β-catenin、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)一抗及山羊抗兔IgG二抗(美国Abcam公司)。Infinite M200酶标仪(瑞士TECAN公司)，光学显微镜(日本尼康株式会社)，DXC800全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司)，E-Gel Imager凝胶成像系统(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 模型制备及分组 60只小鼠中随机取10只作为A组，另50只建立肝纤维化小鼠模型

：以40% 四氯化碳、石蜡油混合液皮下注射，首次注射量根据5 ml/kg体质量标准计算，自第2次开始以3 ml/kg体质量标准计算，每隔4天注射1次，连续4周。建模成功标准

：建模4周后出现体质量下降、毛色黯淡、食欲减少、反应迟钝、萎靡不振等表现，血清AST、ALT、TBil水平高于A组(

<0.05)，镜下显示肝小叶结构破坏，肝细胞变性、坏死，大量炎性细胞浸润，伴假小叶形成。实验后证实，50只小鼠建模成功46只，B组、C组、D组、E组各纳入11、11、12、12只。A组以等量生理盐水皮下注射，10只小鼠均纳入研究。

2.3.3 母血及脐血血脂水平与妊娠指标的相关性分析 母血与脐血TG、TC水平均与新生儿出生体质量、身长、头围、胎盘重量等呈明显正相关(P<0.05)，而LDL-C与HDL-C水平与妊娠指标无明显相关性(P>0.05)。见表7、表8。

2.5 各组小鼠肝组织纤维化程度 Masson染色显示，A组小鼠肝组织内小叶结构无异常，肝细胞周围存在少量排列较整齐胶原纤维。B组、C组肝小鼠小叶破坏较严重，肝实质、中央静脉及汇管区纤维组织增生明显，存在大量胶原沉积，部分形成假小叶，其中B组异常改变更明显。与B组、C组比较，D组、E组小鼠肝组织内小叶结构破坏减轻，纤维结缔组织增生、胶原纤维沉积减少，其中E组改善更显著，见图2。

1.4 动物给药 建模成功后24 h给药。E组以1.0 ml/kg灵芝多糖溶液灌胃，D组以1.0 ml/kg 灵芝多糖、20 μmol/L SKL2001混合液灌胃，B组以20 μmol/L Wnt/β-catenin信号通路激活剂SKL2001溶液灌胃，灌胃体积均为10 ml/kg。A组、C组以同体积生理盐水灌胃。每日1次，连续灌胃6周。

1.5 标本采集及处理 完成腹主动脉血抽取后，小鼠麻醉未清醒前，断头处死，摘取1 cm

大小肝脏组织，以生理盐水冲洗干净，分为4份，其中2份置于4%多聚甲醛固定，2份置于液氮保存。

1.6 指标检测 ①小鼠末次治疗后称重，记录体质量。完成体质量检测后，检测血清AST、ALT、TBil水平，按照仪器及试剂盒使用说明书操作。②ELISA法检测IL-2、IFN-γ、TNF-α水平，根据试剂盒使用说明书严格完成相关操作。③Masson染色法检测肝纤维化程度。取1份4%多聚甲醛固定肝脏组织，流水冲洗1 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明。软石蜡浸蜡1 h，包埋，切片，厚度5 μm。切片平置于载玻片，60℃烘箱烘烤30 min。梯度酒精脱蜡，清水、蒸馏水冲洗。苏木精染核，10 min。1%盐酸酒精分化。醋酸液清洗30 s，入亮绿染色液，染色5 min。醋酸水溶液分化，30 s。酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。④HE染色法检测肝脏组织病理形态学。取1份4%多聚甲醛固定肝脏组织，流水冲洗1 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明。石蜡包埋，切片，厚度4 μm，60℃烘箱内烘烤30 min。二甲苯透明，梯度酒精脱蜡，蒸馏水洗净。苏木精染色，5 min。1%盐酸酒精分化，流水冲洗30 min。伊红染色，梯度酒精脱蜡，二甲苯透明，中性树胶封片。镜下观察并记录肝脏组织病理形态学变化。⑤采用蛋白质印迹法检测Wnt1、Wnt3a、Wnt10、β-catenin、Cyclin D1蛋白相对表达量。取1份液氮保存肝组织，PBS液冲洗，重复2次。冰上裂解，30 min。4℃，12 000 r/min离心，离心半径8 cm，10 min，取上清液。考马斯亮蓝法测定蛋白含量，加2×上样缓冲液，沸水浴变性10 min。10% SDS-PAGE凝胶，蛋白分离，转膜。5%脱脂奶粉封闭，1 h。加入兔抗小鼠Wnt1、Wnt3a、Wnt10、β-catenin、Cyclin D1(1∶1 000)一抗，4℃摇床孵育，过夜。TBST洗膜，每次10 min，重复4次。加山羊抗兔IgG二抗(1∶2 500)，室温，孵育2 h。TBST洗膜，每次10 min，重复4次。加ECL试剂，成像仪曝光成像。目的蛋白表达=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值比值。

2.4 各组小鼠Wnt1、Wnt3a、Wnt10、β-catenin、Cyclin D1蛋白相对表达量 见图1、表4。

2 结果

2.6 各组小鼠肝脏组织病理形态学 HE染色显示，A组小鼠肝脏细胞排列整齐，大小均匀，形态正常，无变性、坏死，小叶结构无异常。B组、C组小鼠出现肝细胞变性、坏死，伴空泡样改变，小叶结构破坏，汇管区存在大量炎性细胞浸润，纤维组织异常增生，假小叶形成。与B组、C组比较，D组、E组小鼠肝细胞坏死、小叶结构破坏程度减轻，汇管区炎性细胞浸润、纤维组织增生减少，其中E组改善更显著，见图3。

如果南水北调工程供水不计所得税，则上述等式可简化为：工程供水价-变动成本=（固定成本+税后利润）/供水量，即：

2.3 各组小鼠IL-2、IFN-γ、TNF-α水平 见表3。

2.2.1 CGF促进牙周组织、牙髓组织再生机制 无论是牙周组织、牙髓组织再生同样都需要干细胞、生长因子和生长支架。CGF提供了大量的生长因子和理想的3D立体网状结构。这些生长因子不仅能调节骨组织中的细胞，还能调节牙周、牙髓干细胞向其受损处迁徙和分化，诱导干细胞合成细胞外基质，促进组织的再生[22]。细胞碱性磷酸酶的活性对牙周膜干细胞的分化能力呈正相关，同时，碱性磷酸酶还参与了牙体组织的构建。碱性磷酸酶活性的增加是牙本质、牙髓形成的标志[23]。国内学者研究发现[24]，CGF可以增强碱性磷酸酶的活性，从而促进牙周组织、牙髓组织和软组织的再生。

②灌溉水有效利用系数：大型灌区不低于0.50，中型灌区不低于0.60，小型灌区不低于0.70，井灌区不低于0.85，喷微灌区不低于0.90，滴灌区不低于0.95。

2.2 各组小鼠AST、ALT、TBil水平比较 见表2。

2.1 各组小鼠体质量比较 见表1。

3 讨论

肝纤维化主要是机体肝组织内细胞外基质过度增生、沉积所致肝脏结构、功能病理改变，具有一定可逆性，但若不及时干预，可逐渐进展为肝硬化，甚至肝癌

。研究发现，免疫功能异常改变是引发肝组织损伤的一个重要因素，故需在肝纤维化治疗期间加强免疫调节

。肝纤维化形成过程受较多靶点影响，故单一靶点药物较难发挥理想效果，目前尚无十分有效的西药。中医学认为，肝纤维化根据症状体征可纳入“癥积”“胁痛”“臌胀”等范畴

，主要病理因素包括虚、热、湿、毒、瘀等。肝纤维化临床无特异性，辨证复杂，尚无统一分型标准，考虑到该病为多种慢性肝病长期发展结果，可累及气血，久病入络，致正虚血瘀，故治疗当以活血化瘀、扶正补虚为主

。

灵芝为传统中药材之一，具有活血化瘀、清肝泻火、补虚壮骨、扶正固本的功效，而灵芝多糖为灵芝有效成分之一，具有保护肝脏、降血糖、抗肿瘤、免疫调节、抗缺氧等多种药理作用

。还有学者提出，灵芝多糖可通过减少TNF-α合成，防治慢性肝炎患者肝损伤，且其肝保护作用与免疫调节、抗脂质过氧化有关

。IL-2、IFN-γ、TNF-α与机体免疫功能密切相关。其中，IL-2有较广泛免疫增强效应，且可激活脾淋巴细胞对羊红细胞产生抗体的应答反应，促进IFN-γ产生。IFN-γ具有较强免疫调节、抗纤维化作用。IFN-γ、IL-2分泌增加，可降低TNF-α水平，改善免疫功能，发挥抗肝脏纤维化损伤作用

。本研究结果显示，灵芝多糖组治疗后AST、ALT、TBil水平降低，体质量及IL-2、IFN-γ水平升高，TNF-α降低，肝纤维化程度、肝脏组织病理形态学异常改变有所减轻，这提示灵芝多糖可减轻肝纤维化小鼠肝损伤，改善免疫功能，保护肝脏组织。蔡德雷等

也发现，灵芝多糖可减轻肝纤维化小鼠肝功能损伤，抑制肝纤维化，与本研究结果一致。

（2）检查通报：重庆市婚管中心每月不定期对项目单位进行检查和电话抽查，以了解项目实施情况。同时对于实施情况不符合要求的项目单位，提出限期整改、缓拨经费、减少经费、暂停项目或终止项目的处理意见。重庆市婚管中心每两月对项目单位进行项目错情通报，一方面对项目实施中出现的错情进行通报批评，并依据扣分规则对终期评估进行扣分，另一方面也要对各项目单位实施效果进行排名，连续两次排名在后3名的项目单位，将扣除项目总经费1%。

Wnt糖蛋白家族在机体细胞分化、增殖、极性产生及器官发育中发挥重要作用。β-catenin多表达在细胞膜黏连连接处、细胞核及游离细胞质中，不仅可调控细胞生长、分化、增殖等过程，还可经由与细胞膜上钙黏蛋白cadherin产生作用，影响细胞侵袭、转移

。马琼等

研究中提出，由β-catenin介导的Wnt/β-catenin信号通路在调节上皮细胞-间充质转化中具有重要作用，可影响肝纤维化发展过程。报道显示

，人肝星状细胞核上存在β-catenin蛋白累积，且可促使纤维化基因表达上调。还有研究发现

，经由下调Wnt/β-catenin信号通路，可抑制慢性丙型肝炎向肝细胞癌的进展。另外，报道显示

，阻断Wnt/β-catenin信号通路，可经调节免疫反应，影响肺部炎症，暗示其免疫调节作用。这些研究均提示，Wnt/β-catenin信号通路可能在肝纤维化疾病控制及免疫调节中有一定作用。本研究发现，灵芝多糖应用后小鼠Wnt1、Wnt3a、Wnt10、β-catenin、Cyclin D1蛋白相对表达量降低，且经应用Wnt/β-catenin信号通路激活剂进一步验证，这提示灵芝多糖可抑制Wnt/β-catenin信号通路，推测这可能是灵芝多糖改善肝纤维化小鼠肝损伤、免疫功能的重要作用机制之一。

综上所述，灵芝多糖可减轻肝纤维化小鼠肝损伤，改善其免疫功能，缓解肝纤维化程度，作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。本研究不足之处包括：实验时间有待延长，以获得更为稳定的肝纤维化小鼠模型；实验仅分析了灵芝多糖经Wnt/β-catenin信号通路发挥的作用，未研究其他途径，故今后仍需进一步深入分析。

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