蛇床子素植物半乳糖脂肝靶向脂质体对HepG-2细胞的影响研究

中国是全球肝细胞癌(HCC)发病率最高的国家，年发病人数占全世界的55%，死亡人数占全世界的45%；最新统计资料显示，2015年肝癌发病率占我国肿瘤总发病率的第4 位、死亡率占第2位

。目前，化疗仍是肝癌常用治疗方法。不过化疗药物通常毒性大，缺乏肝部位选择性，给药后往往出现全身严重不良反应。因此，应用低或无毒的中药活性成分、开发新的药物成为肝癌防治的热点。蛇床子素是中药蛇床子的主要活性成分。研究表明，蛇床子素具有良好的安全性，并具有抗肝癌、胆管癌、肺癌、前列腺癌等作用

，但其难溶于水、生物利用度低、体内分布广泛、缺乏肝肿瘤部位选择性，限制了其临床应用

。

肝实质细胞等表面高表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，又称半乳糖受体。该受体能特异地识别半乳糖残基，当其与半乳糖基结合后，即发生受体介导的胞吞作用。因此，可将药物或载体等经半乳糖基修饰制成以ASGPR受体为介导的肝靶向制剂

。丁瑞华等

研究结果表明，半乳糖基修饰的脂质体有更好的肝靶向能力和区分肝癌细胞与正常细胞的能力。在燕麦、稻草等植物叶绿体膜中含有大量半乳糖基的植物半乳糖脂，其中双半乳糖基二酰甘油酯(DGDG)是其主要组成成分之一。DGDG与卵磷脂(PC)的几何结构非常相似，均具有明显的表面活性。李新刚等

报道双半乳糖基二酰甘油酯(DGDG)可以制备稳定的脂质体和亚微乳液。半乳糖脂可以作为膜材制备纳米制剂，同时因其含大量半乳糖基，能与ASGPR受体结合，可以作为肝靶向配体，将省去半乳糖基配体的化学合成制备过程，无疑将大为简化肝靶向脂质体制备过程，提高肝靶向纳米制剂研制效率和成药性。为此，本研究将蛇床子素制备成蛇床子素半乳糖脂肝靶向脂质体制剂，并研究其体外抗人肝癌HepG-2细胞的作用，为下一步体内研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 原料及试剂 蛇床子素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110822-200409);蛇床子素原料药(源叶生物，批号T08M8836，质量分数>98%)；燕麦中半乳糖脂参照文献方法

制备。聚氧乙烯基氢化蓖麻油(上海源叶生物，Y27A8S34920)；1640培养基(北京海克隆生物化学制品有限公司)；四季青无支原体胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；CCK-8试剂盒(Beyotime，批号C0037)；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物，批号KGA1026)；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物，批号KGA512)。小鼠单抗β-actin(武汉博士德生物工程有限公司，批号BM0627)；兔多抗P53(53KD)(武汉三鹰生物技术有限公司，批号10442-1-AP)。

综上所述，更昔洛韦联合利巴韦林雾化吸入治疗可明显提高小儿疱疹性咽峡炎治疗效果，改善患儿临床症状体征，提高血清IgG、IgA、IgM水平。但本研究纳入病例数目有限，观察指标较少，未能全面评价其效果，有待作进一步研究探讨。

1.2 主要仪器 Agilent1290 HPLC仪(美国)；Beckman超高速离心机(美国)；HF90细胞培养箱(力康生物医疗科技控股有限公司)；5424离心机(艾本德中国有限公司)；Cytoflex流式细胞仪(中国贝克曼库尔特商贸有限公司)；F50酶标仪(上海帝肯贸易有限公司)。

1.3 细胞株 HepG-2细胞株(CL-0103)，购自于武汉普赛尔生物公司，冻存保种。

1.4 蛇床子素植物半乳糖脂肝靶向脂质体的制备 在50℃的水浴上，将燕麦半乳糖脂提取物200 mg、聚氧乙烯基氢化蓖麻油200 mg溶于3 ml无水乙醇中，保温5 min，加入蛇床子素原料药10 mg，保温5 min，然后用5 ml注射器以1 ml/min匀速缓慢地将乙醇液滴入到水浴锅上另一个含20 ml重蒸水的玻璃杯中，同时开启搅拌机，转速250 rpm/min,搅拌15 min后再继续水浴放置20 min。取出，室温放置24 h，200 nm微孔滤膜过滤即得500 μg/ml的蛇床子素植物半乳糖脂肝靶向脂质体,产品4℃冰箱保存。空白脂质体制备方法同上，不加蛇床子素。

1.6 超高速离心法测定包封率 制备3批脂质体，每批取适量样品分别密封于3支配套软管中，设置离心温度10℃、转速80 000转/分，离心2 h；取上清液10 μl于离心管中，再加入190 μl无水乙醇，50℃水浴保温5 min，即制得离心检测样品。取样品10 μl，用高效液相仪测定离心样品中蛇床子素含量(A)。另直接取蛇床子素植物半乳糖脂脂质体10 μl于另一离心管中，加入190 μl无水乙醇，50℃水浴5 min，制备脂质体检测样品，取10 μl用高效液相色谱仪测定蛇床子素含量(B)。

适量脂质体样品双蒸水稀释，用Nano ZS90纳米粒度仪测定脂质体粒径与电位。

2.1 制备脂质体的形态及粒径电位 电镜观察脂质体形态结果见图1，结果表明脂质体形态圆整，大小均一。脂质体粒径为145.9±10.53 nm(

=3)，PdI 0.29±0.14(

=3)；电位为-25.7±0.21mv(

=3)。

1.5 脂质体形态及粒径电位 采用透射电镜观察脂质体形态：取少量脂质体液体滴于电镜配套铜网表面，滤纸吸去多余溶液，再滴入1滴3%磷钨酸溶液，染色3 min， 吸去多余液体，晾干，透射电镜观察。

1.7 CCK-8法检测HepG-2细胞增殖抑制 取对数期生长的人肝癌HepG-2细胞5×10

/ml，加入96孔板中，每孔100 μl，培养过夜。用1640培养基将药物倍比稀释：蛇床子素组浓度为40、20、10、5 μg/ml；蛇床子素脂质体含蛇床子素也为40、20、10、5 μg/ml的脂质体稀释溶液；空白脂质体为与蛇床子素脂质体相同稀释倍数的空白脂质体溶液；聚氧乙烯基氢化蓖麻油组稀释方法同空白脂质体组；正常对照组为不进行任何处理的细胞。吸弃板中的培养基，加入100 μl含药培养基；每个浓度设5个复孔。分别处理24 h、48 h后，按CCK-8试剂盒要求操作，检测吸光度值(A)，计算细胞增殖抑制率。

增殖抑制率=1-A

/A

新零售要求店家利用互联网和人工智能等新技术，通过线上+线下的双重引流消费者到店，然后以产品为中心，为客户提供高用户体验和高性价比的购物体验，并整合运营管理的各个环节，创造更大价值，提升运营效率。

而业务人员的绩效工资挂靠于各个市场业绩任务达成，城市经理、区域经理等管理人员的绩效工资挂靠于整体市场业绩任务达成，都没有考虑到经销商撤销等异常情况，导致一旦某个市场经销商存在空缺，各级人员薪资水平均会受到较大影响，这催促着无论是领导层还是业务人员，都需要尽快寻找经销商来进行销量的补缺。但在较短的时间内，业务人员势必无法对当地市场的备选经销商做出详细了解和调研，多是走访几个经销商后，就仓促确定。此外，前期调研不充分也导致部分客户资质刚刚满足公司要求便设立为经销商，后期运营乏力，不利于产品在当地市场的拓展。

取对数期生长的人肝癌HepG-2细胞5×10

/ml，接种到6孔板中，每孔1 ml，于37℃、5% CO

条件下培养过夜，移去培养基，PBS洗2次。正常组：加入1640完全培养基；姜黄素组：加入含姜黄素10 μg/ml的1640完全培养基；姜黄素脂质体组：加入姜黄素脂质体10 μg/ml(含姜黄素)的1640完全培养基；空白脂质体组：加入与姜黄素脂质体相同稀释倍数的空白脂质体；每个样品平行3孔，分别培养1 h、2 h、4 h；移去培养基，用PBS润洗2次。用0.25%胰酶(不含EDTA)消化细胞，消化后，1 500 rpm离心5 min，去上清，加PBS重悬；用PBS润洗2次，1 500 rpm离心5 min；去上清，加500 μl PBS重悬；激发波长488 nm，发射波长530 nm处，流式细胞仪检测细胞摄取。

近年来，一些研究表明，索氏的“语言”实际上是科学主义的产物[20-21]。所谓科学主义，是指主张把自然科学的方法应用于人文社会科学在内的一切研究领域的观点。科学研究往往需要去除各种“杂质”的影响，索绪尔的语言学理论中含有科学主义的因素，他提出的变革方法就是要开展一场“同质化”运动”[22]364。这里我们有必要深究两个问题：(1)社会科学为什么要去除杂质，开展同质化运动？(2)社会科学是如何去除杂质，达到同质化这一目的的？

目前Ce3+掺杂钇铝石榴石(Ce3+：YAG)在白光LED领域已经有着广泛的应用[5]。常用的制备WLED的方法就是利用黄光和蓝光混合产生白光，其中蓝光由LED蓝光芯片产生，黄色的产生则是将Ce3+：YAG荧光粉与胶体的混合物涂在芯片上[6]。目前对于Ce3+离子掺杂材料的应用，主要是基于可见光尤其是蓝光波段的激发照射，使其发出黄绿色的可见光，利用短波长激发出长波长光的现象称为下转换荧光。而如果能够利用波长更长的光源去激发Ce3+的离子的5d-4f跃迁，则可以更加扩展这种材料的应用范围。

1.9 细胞凋亡检测 采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡 取对数期生长的HepG-2细胞5×10

个/ml，于6孔板中，每孔加2 ml，培养过夜；用1640培养基稀释药物：蛇床子素组浓度10 μg/ml；蛇床子素脂质体(换算后含蛇床子素)10 μg/ml；对照组为不加药处理的正常细胞。以上每个样品平行3孔，然后按试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.10 细胞周期检测 细胞消化后PBS洗2次，离心，沉淀用250 μl PBS重悬，再加入750 μl无水乙醇，4℃固定2 h；3 000 rpm离心5 min，除去上清液，加1 ml PBS重悬，再3 000 rpm离心5 min，收集细胞；吸弃PBS，加500 μl碘化丙啶染色液，37℃孵育30 min；采用流式细胞仪检测细胞周期。

1.11 Western Blot检测p53表达 收集细胞，加入细胞裂解液，裂解30 min；期间每隔10 min重悬细胞一次；采用超声波裂解细胞5 s后， 12 000 rpm离心15 min，取上清，按照BCA定量试剂盒测样品蛋白浓度；经电泳，电转移，免疫印迹显色，晾干胶片，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。

色谱条件Agilent1290 HPLC仪；色谱柱：C18柱Cosmosil(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水(75∶25)；流速：1.0 ml/min；柱温：25℃；检测波长：322 nm。检测后，计算包封率C，公式为C=(B-A)/B。

2 结果

最大功率(PS/rpm) ...............................................75/8500

2.3 细胞摄取实验结果 1 h时点内，姜黄素组摄取姜黄素与对照组比较没有明显差异；2 h和4 h时点，摄取姜黄素则明显增强(

<0.01)；与对照组比较，姜黄素脂质体的摄取率在1、2和4小时内均明显增加(

<0.01)；而且，在不同时间点，姜黄素脂质体组细胞摄取量均比游离姜黄素组显著升高(

<0.01)。见表1。

1.8 人肝癌HepG-2细胞药物摄取 由于蛇床子素没有荧光，不能用流式细胞仪检测细胞吸收状况。姜黄素溶解特性与蛇床子素相似，而且有荧光，可以用流式细胞仪检测细胞吸收状况，因此，选用姜黄素代替蛇床子素进行体外细胞摄取实验。姜黄素脂质体制备方法同1.4项下方法，只是用10 mg的姜黄素代替蛇床子素。

20世纪90年代末到21世纪初，宽甸县的年日照时间呈先降低后增长的变化趋势。年最长日照时间出现在1991年（2 561 h），年最短日照时间出现在1998年（2 069.5 h），两者相差491.5 h，如图5所示。

2.2 蛇床子素脂质体包封率结果 蛇床子素HPLC法经方法学考察，在本文测定条件下,各种辅料对蛇床子素的测定无干扰。日内精密度表明峰面积RSD值为1.07%。平均回收率为98.23%, RSD值为1.35%。蛇床子素的峰面积(X)与药物浓度(Y)的回归方程为：Y=0.0 257 X-0.6 758,r=0.9 997，线性关系良好。脂质体包封率=93.47±1.34%(

=3)。

2.4 细胞增殖抑制实验结果 随蛇床子素、蛇床子素脂质体浓度的增加，细胞增殖抑制效果增强，呈剂量依赖性；48 h与24 h相比，随时间延长，蛇床子素、蛇床子素脂质体相应浓度组对HepG-2细胞的增殖抑制作用增强(

<0.01)，呈时间相关性；蛇床子素脂质体组较相对应浓度的蛇床子素组，对HepG-2细胞的增殖抑制作用均呈现显著增强效应(

<0.01)。空白脂质体在实验中的高浓度显示出了一定的肿瘤抑制活性，说明植物半乳糖酯有一定的抑制HepG-2细胞的作用。因聚氧乙烯基氢化蓖麻油作为对照进行实验时没有任何抑制作用，表中未列出。见表2。

2.5 细胞凋亡实验结果 蛇床子素、蛇床子素脂质体对HepG-2细胞的凋亡作用见图2、表3。与对照组比较，蛇床子素、蛇床子素脂质体组，早期、晚期及总凋亡率均明显增强(

<0.01)；脂质体组较蛇床子素组早期、晚期及总凋亡率均明显增强(

<0.01)。空白脂质体显示出诱导细胞晚期凋亡的活性，说明植物半乳糖酯有诱导HepG-2细胞晚期凋亡的作用。

2.6 蛇床子素及蛇床子素脂质体对HepG-2细胞周期的影响蛇床子素、蛇床子素脂质体作用HepG-2细胞24 h后，对HepG-2细胞周期的影响见表4、图3。与对照组比较，蛇床子素、蛇床子素脂质体组对HepG-2细胞G1期占比明显升高(

<0.01)，G2期占比明显下降(

<0.01)。与蛇床子素组比较，蛇床子素脂质体组G1期占比升高明显(

<0.05)。说明蛇床子素、蛇床子素脂质体均具有G1期阻滞作用，蛇床子素脂质体对细胞G1期阻滞作用较蛇床子素更强。空白脂质体显示出细胞G1期阻滞作用，说明植物半乳糖脂对HepG-2细胞有G1期阻滞作用。

2.7 p53表达水平 蛇床子素、蛇床子素脂质体对HepG-2细胞的p53表达水平结果如图4，表5。蛇床子素、蛇床子素脂质体组与对照组比较，p53表达水平均明显上调(

<0.05,

<0.01)；蛇床子素脂质体较蛇床子素更明显上调p53的表达(

<0.01)，但空白脂质体对p53表达水平影响不明显。

4 讨论

纳米肝靶向给药系统能将抗肝癌药物运送到肝肿瘤部位，增加肝肿瘤部位药物浓度，同时减少药物对其它脏器的细胞毒性，降低药物的全身毒副作用。因此，肝靶向研究成为临床和临床前药物研究的核心问题。

有砟轨道床在时速350 km/h的条件下容易发生道砟飞溅现象，此次“高速铁路固化道床防飞溅高分子材料涂层”的研发与应用，通过将防飞溅涂层喷洒至道床表面区域，促使表面道砟颗粒发生固化，从而防止列车风荷载作用下发生道砟飞溅的现象，对保障线路的行车安全具有重要意义。

本研究结果表明，蛇床子素及其脂质体对HepG-2细胞增殖抑制效应呈剂量依赖性和时间依赖性，剂量越大，抑制作用越强；相同药物浓度下，药物处理时间越长，细胞增殖抑制效应越强。相同条件下，蛇床子素脂质体对HepG-2细胞增殖抑制较游离蛇床子素作用更强。由于蛇床子素没有荧光，不能用流式细胞仪直接检测细胞吸收状况。对没有荧光的化合物不能直接进行肿瘤细胞摄取研究时，往往会采用6-香豆素等具有荧光的化合物代替进行

。姜黄素物理特性与蛇床子素相似，而且有荧光，因此实验中选用姜黄素代替蛇床子素进行游离药物和脂质体体外细胞摄取比较实验。结果表明，脂质体在不同时间点的吸收明显大于游离药物。文献报道，细胞摄取是药物递送应用的重要参数之一，而且纳米制剂的稳定性也可以通过细胞摄取来确定

。此外， 肿瘤细胞吸收的药物越多，靶向肿瘤细胞的作用就越强

。因此，本研究细胞摄取研究结果表明，所制备脂质体具有良好的稳定性，也具有良好的肝肿瘤HepG-2细胞靶向性。对HepG-2细胞的凋亡诱导作用结果表明，蛇床子素及其脂质体与对照组比较，早期、晚期及总凋亡率均明显增强。与游离蛇床子素相比，蛇床子素脂质体处理后，细胞早期、晚期及总凋亡率均明显增强。细胞周期影响结果表明，蛇床子素组及其脂质体组均具有G1期阻滞作用，但蛇床子素脂质体较蛇床子素G1期阻滞作用更强。肝癌的治疗，除了早期手术治疗，目前并无其它有效的办法，因此，寻找新的抗肿瘤分子靶位的研究越来越受到关注。p53是研究最多的抑癌基因之一，其与细胞周期的调控、DNA 修复、细胞分化及细胞凋亡等密切相关

。实验表明，蛇床子素及其脂质体均能明显上调p53的表达，而蛇床子脂质体较蛇床子素上调p53作用更强。

以上研究结果提示蛇床子素可能是通过上调 p53 的表达抑制HepG-2细胞的异常增殖和诱导凋亡，从而发挥抗肝癌的作用。

本文研究表明，将蛇床子素制备成蛇床子素半乳糖脂肝靶向脂质体后，显著增强了对HepG-2细胞的抑制作用, 也显示出了良好的人肝癌HepG-2细胞靶向性。实验结果也表明，半乳糖脂在较高浓度显示出了一定的抗HepG-2细胞的作用,具有抑制HepG-2细胞的增殖、诱导晚期凋亡、及细胞G1期阻滞等作用。因此，植物半乳糖脂含有半乳糖基，可作为肝靶向配体，其还具有一定的抗人肝癌HepG-2细胞活性，这些特性对采用半乳糖脂作为膜材制备半乳糖脂肝靶向脂质体具有明显优势。蛇床子素植物半乳糖脂肝靶向脂质体体内抗肝癌作用如何，有待进一步研究。

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