根际促生菌-黑麦草联合修复重金属Pb污染土壤

焦郑同， 朱 琳， 邹海明， 王 艳

(安徽科技学院 资源与环境学院，安徽 凤阳 233100)

随着工农业生产现代化的快速发展,人类活动产生的污染物伴随着降水、地表径流等迁移到土壤当中,导致土壤中污染物的积累,造成了各种土壤环境问题[1]。其中,最为显著的就是重金属污染问题,全球范围内多种重金属元素的平均排放水平严重超标,重金属污染情况极其严峻[2-3]。欧盟的农业用地中有超过1 370万公顷的土地遭受不同程度的重金属污染并亟需治理。目前,我国土壤重金属污染情况十分严峻,自然资源部报告称,截至2020年,我国重金属污染土壤已达2 000万公顷左右,占耕地面积的10%以上。由于重金属在土壤中具有滞后性、累积性、不可逆性、长期性及毒害性等特点[4],富集在土壤中的重金属无法降解,对土壤功能、人类身体健康等构成严重的威胁[5]。尽管重金属因其自身特性,在土壤中迁移性较差,但经过雨水的洗涤会随着水流进入地表径流或地下水,形成面源污染,对生态功能结构以及人类的身体健康产生危害[6-7]。因此,如何有效修复重金属污染的土壤已成为环境研究领域的热点[8]。

植物修复是一种通过植物对土壤中重金属的固定、吸收等作用对污染土壤进行修复的一种技术,因其成本效益及环境友好性被科学界认可。在选择重金属污染修复所用植物时,应根据污染区域的具体情况,筛选在重金属污染区域受毒害影响不明显、对重金属拥有较强富集能力的植物[9]。超积累植物(hyperaccumulator)是指地下部分可从土壤中吸收超量的重金属,并将其转移到地上部分,地上部分所含重金属超过一般植物地上部分100倍以上[10]。但是受到超积累植物其本身生物量和生长周期等因素的制约,植物修复需要漫长的过程,其大规模应用有待进一步的研究[11-12]。因此,如何提高植物修复的效率是使用植物修复技术来进行污染土壤修复亟待解决的问题。

植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是指生活在土壤或定殖于植物根际,并通过分泌植物激素、铁载体等方式促进植物生长、增强植物抗逆性的有益菌[13]。根际促生菌可以增加ACC脱氨酶的活性,分解在逆境中植物产生的乙烯合成前体ACC,降低乙烯的浓度,从而缓解植物的不良反应[14]。同时根际促生菌液可以分泌生长素IAA、赤霉素GA等多种植物激素来促进植物生长[15]。Ahmad等[16]研究发现,根瘤菌及假单胞菌混合接种可提高绿豆光合作用率、水的利用效率以及叶绿素含量,降低高盐度对植株生长的不利影响,促进绿豆植株生长、提高果实质量。Lim等[17]等研究发现,接种PGPR菌株地衣芽孢杆菌K11的胡椒植株耐受干旱胁迫的能力增强。刘东昀等[18]筛选出根际促生菌-Enterobactersp.EG16,该菌能分泌铁载体,缓解镉对植物的胁迫,并能促进植物生长。Bacillussp.E5与丛枝菌根真菌共同接种会增加生菜的抗旱能力。

微生物-植物联合修复是目前提高植物修复效率最主要的方法,近年来发展迅速[19]。研究表明,植物与微生物共存能增强植物的重金属抗性,拥有较理想的修复效果[20]。一方面,部分微生物可促进植物的生长,增强植株抗逆性;另一方面,植物在抗重金属过程中也能提高这些微生物的抗重金属能力[21],使微生物在重金属胁迫条件下仍能存活,并发挥促进植株生长、增强植株抗逆性的作用。卢琪等[22]研究发现樊庆生红球菌对于超积累植物东南景天修复重金属污染土壤方面具有显著性的有益效果。Hassan等[23]研究发现,根际细菌菌株AN8可以显著的减少铅污染的毒害效果。Grobelak等[24]研究发现根际促生细菌Agrostiscapillari在 Pb、Zn、Cd等混合重金属胁迫条件下,能显著提高油菜花的存活率。

本研究通过盆栽实验研究根际促生菌(樊庆生红球菌,Rhodococcusqingshengii)与超积累植物黑麦草联合修复重金属铅污染土壤的能力,旨在为利用黑麦草进行重金属污染土壤的修复及后续应用提供理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株为安徽科技学院资源与环境学院实验室保存的Rhodococcusqingshengii(樊庆生红球菌)。从-80 ℃冰箱取出甘油保存的菌株后,于LB(Luria-Bertan)培养基中活化。活化至第二代后取1 mL接种于50 mL无菌LB液体培养基于恒温震荡箱(转速200 r/min,温度30 ℃)中培养3 d。将培养后的菌液于高速冷冻离心机中离心,离心速度3 000 r/min,离心时间10 min收获菌体,并用0.9%无菌生理盐水洗涤3次,使用无菌生理盐水溶解为菌悬液。通过紫外可见光光度法测定菌悬液浓度。本研究中菌悬液吸光度为0.177。

供试植株为一年生黑麦草,种子购买于浙江宁波某种业公司。播撒前,使用75%乙醇溶液表面消毒15 min,并用无菌水冲洗3次。

1.2 实验方法

1.2.1 实验组处理以及对照组设置 使用营养土种植黑麦草进行室内培养试验,共设置6个处理,分别为：土壤中不含外源铅不接种菌液(CK)、土壤中不含外源铅接种菌液(CK+R)、模拟农业污染土壤不接种菌液(C1)、模拟农业污染土壤接种菌液(C1+R)、模拟林业污染土壤不接种菌液(C2)、模拟林业污染土壤接种菌液(C2+R),每个处理9次重复。其中模拟林业污染土壤中Pb的终浓度为4 689.45 mg/kg,模拟农业铅污染土壤中Pb的终浓度为745.98 mg/kg。每个实验组含营养土395 g,放置4个月老化稳定后用于实验。

1.2.2 植物的培养 将一年生黑麦草种子均匀播撒于土壤表面中,在种子上覆一层薄土,浇水50 mL。每盆样品100粒种子。在植物生长期间,每隔一段时间用等量超纯水浇灌生长基质,以保持土壤湿润。

1.2.3 根际微生物施加 在黑麦草生长两周后,向预接种樊庆生红球菌的实验组(CK+R、C1+R、C2+R)中施加40 mL菌悬液。向未接种樊庆生红球菌的实验组(CK、C1、C2)浇灌40 mL生理盐水。

1.2.4 样品采集 黑麦草在根际接种菌液生长2周后,收获植物,尽量保持黑麦草根系的完整,用去离子水冲洗后,观察、测量。

1.3 测定项目及分析方法

黑麦草样品进行重金属含量测定前,将分离的黑麦草地上部与地下部洗净后分别装入信封,使用烘箱105 ℃杀青30 min,75 ℃烘干至恒重后磨成粉末过筛装入密封袋备用。

使用微波消解法[25]处理样品，将聚四氟乙烯消化管在盐酸溶液中浸泡12 min,清洗干净用超纯水润洗、烘干,向各个消化管内加入0.1 g研磨后过筛的样品,然后加入10 mL浓硝酸、3 mL浓盐酸、2 mL氢氟酸。将聚四氟乙烯消化管放入微波消解炉中,使用扳手固定,消解50 min。消解完成后取出消化管,待其冷却至室温,向消化管中加入2 mL双氧水放入赶酸仪中进行赶酸。温度设置为170 ℃,待消化管中剩下2 mL以下的溶液后,赶酸完成。取出消化管,冷却至室温后,将消化管中的液体倒入25 mL比色管中,用1%的稀硝酸润洗消化管并定容至25 mL,过滤后用于ICP-OES(电感耦合等离子体发射光谱仪)上机测定。

吸取1 000 μg/mL铅标液定容,使标线浓度达到1、5、10、15、20 μg/mL,用于ICP-OES标准曲线的绘制,并使用ICP-OES对消解后的样品进行测定。

2 结果与分析

2.1 黑麦草生长情况变化

黑麦草生长状况如图1所示,CK、CK+R、C1、C1+R组黑麦草地上部无明显差异,与CK、CK+R相比,C2、C2+R实验组的地上部长度为对照的84.7%、77.8%。可见樊庆生红球菌的施加对于植物的生长无负面影响,且黑麦草在铅胁迫环境中抗逆性较强。将C2+R与C2对比,C2+R组黑麦草地上部长度仅为C2的88.5%,在接种菌液后黑麦草地上部生长受到抑制,这与王元昌等[14]亚麻接种根际促生菌富集镉砷地上部分生长受抑制结果相同。

接种了樊庆生红球菌的CK+R、C1+R、C2+R实验组地下部与未接种的CK、C1、C2实验组相比增幅18.5%、15.3%、22.4%,说明樊庆生红球菌拥有促进植物地下部生长的作用,提高了植物的抗逆性。与李靖等[26]根际促生菌增强巨菌草地下部生长结果相同。与吴慧丽等[27]将根际促生菌接种至黑麦草根系,黑麦草株高增加结果相同。与C2相比C2+R组根部受到促进,表明在高铅胁迫的林业土壤中樊庆生红球菌仍能存活,并起到增强植物抗逆性的作用。将C1、C1+R与CK、CK+R相比可发现C1、C1+R实验组黑麦草地下部长度为空白对照组的96%、93.8%,将C2、C2+R实验组与CK、CK+R相比可发现,C2、C2+R的地下部长度仅为空白对照的82.7%、85.4%,结果表明樊庆生红球菌对黑麦草地下部生长的促进效果与重金属Pb含量成反比。接种微生物后生物量有明显增加,说明微生物能有效缓解 Pb对植株的毒害,提高植株抗逆性,使植株可正常生长,这与张胜爽[28]研究结果一致。

接种樊庆生红球菌促进了黑麦草地下部分的生长,但其地上部分无明显变化甚至受到抑制(图1),这可能一方面是实验时间较短,地下部分未生长至最终形态,对养分消耗较大,使得叶片无法吸收足够的养分生长。另一方面根际促生菌促进地下部分生长后,地下部分在吸收养分的同时对重金属起到了超量富集的作用,铅的胁迫使得黑麦草叶片无法良好生长。

图1 黑麦草生长状况

2.2 植株各部位重金属含量结果分析

黑麦草地上部重金属含量的变化情况见表1,在模拟农田铅污染土壤修复实验组中,C1+R组黑麦草地上部铅含量与C1相比明显增加,增长率为104%。在模拟林业铅污染土壤修复组中,将C2+R与C2相比,可发现黑麦草地上部铅含量存在一定程度的增长,增长率为30%。结果表明接种樊庆生红球菌后黑麦草地上部重金属铅含量显著增加,这说明根际接种樊庆生红球菌对植株富集重金属铅有着促进作用,可以提高植株修复重金属污染土壤的效率,但接种樊庆生红球菌对黑麦草吸收重金属铅的促进作用随着土壤中重金属含量的增长缓慢降低,说明黑麦草富集的重金属铅对于黑麦草的生长存在毒害作用,但黑麦草自身抗铅胁迫能力较强,同时接种樊庆生红球菌后增强了黑麦草抗逆性,确定了樊庆生红球菌-黑麦草联合修复重金属污染土壤是一条可行的道路。

黑麦草地下部铅含量如表1所示,在模拟农田铅污染土壤修复组中,与C1相比,C1+R的地下部铅含量增幅为2.3%。在模拟林业铅污染土壤修复组中,与C2相比,C2+R的地下部铅含量增幅为2.2%。结合表1地上部铅含量可知,虽然接种樊庆生红球菌后黑麦草地下部铅含量增长率较低,但黑麦草地下部铅含量远高于地上部铅含量,说明黑麦草富集重金属铅的主要部位为地下部。本试验中,接种樊庆生红球菌后能增加一年生黑麦草的铅含量,这一现象可以解释为,一方面接种樊庆生红球菌促进黑麦草地下部生长,从而强化黑麦草对重金属的富集能力,另一方面樊庆生红球菌接种活化土壤中的铅,促进了黑麦草对铅的吸收,进一步导致了铅的高积累。与孙楠等[29]接种根际微生物,致使桂花和栀子花体内 铅、Cd 含量随外源重金属添加量增加而增加,均表现为地下部高于地上部结果相同。

表1 黑麦草植株Pb含量

3 结论

本实验通过樊庆生红球菌与黑麦草联合修复技术对铅污染土壤进行修复,得到以下结论:

(1)在相同培养条件下,相较于对照组CK,CK+R处理组中黑麦草长势未有明显变化,说明接种菌液对黑麦草的生长无负面影响。C1、C1+R模拟农田污染处理组与对照组CK相比,地上部分无明显变化。而比较模拟林业污染土壤(C2、C2+R处理组)与对照组(CK、CK+R),可发现高浓度铅污染将对黑麦草的生长产生一定程度的抑制。比较模拟林业污染土壤中C2+R处理组与C2,可发现在接种菌液后,由于黑麦草富集了过量重金属,导致其地上部生长受到一定程度的抑制。

(2)在相同培养条件下,相较于CK、C1、C2的实验组,根际接种樊庆生红球菌的处理组CK+R、C1+R、C2+R中,黑麦草地下部的生长明显受到促进,增长率分别为18.5%、15.3%、22.4%。说明樊庆生红球菌有助于地下部的生长,有利于植株从土壤中吸收养分、富集重金属,对植株在逆境中的生长有着积极的促进作用。

(3)在模拟农业土壤中,根际接种樊庆生红球菌的黑麦草(C1+R)植株地上部及地下部铅含量与未接种菌液的处理组(C1)相比,分别增加了104%、2.3%。在高污染的林业土壤中,C2+R实验组地上部、地下部与C2实验组相比,铅含量分别增加了30.25%、2.2%。说明根际施加樊庆生红球菌有利于黑麦草对于重金属铅的富集。

综上所述,樊庆生红球菌促进了黑麦草对于重金属铅的吸收,樊庆生红球菌-黑麦草联合修复技术可以用于修复铅污染土壤,为土壤重金属污染修复提供新方法,并为微生物菌剂的研发提供新思路。