DeFine.TB与Xpert-MTB/RIF诊断肺外结核的比较

刘泽世 耿妍 雷静 李靖 殷鉴 张彦平 耿燕★

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起结核病的病原体，已成为全球性的重大健康问题。人体除毛发、指甲等部位不会感染结核外，其他所有部位均会感染。流行病学调查显示：全球范围内新发病例1 000 万，死亡120 万，其中16%为肺外结核，我国新发结核病例数占全球的8.4%，仅次于印度和印度尼西亚而位居世界第三，肺外结核的发病率也处于较高水平［1］。然而，同肺结核相比，肺外结核患者的临床表现不典型，且受感染部位限制，肺外结核患者不易获得适宜实验室检查的标本等因素，常规诊断技术对肺外结核的诊断效能不明确。因此，肺外结核的早期诊断是临床上的一大难题。涂片镜检是基于抗酸染色鉴定涂片中是否存在抗酸杆菌［2］。培养方法是诊断MTB 的金标准，且在培养出细菌后还可加做药物敏感性试验。但涂片镜检的敏感度和特异性有限。而培养不仅极其耗时（需要数天才可能有结果），且还需特殊设备和实验室条件。因此，临床急切需要快速且敏感度、特异度高的诊断方法，达到及早诊断，尽快治疗的目的。随着越来越多的基于免疫学或分子学诊断方法的出现，诸如结核分枝杆菌特异性细胞因子检测（Mycobacterium tuberculosis-specific cytokine combined detection，DeFine.TB）已被指南推荐为用于肺外结核和菌阴肺结核的辅助诊断方法［3］。近年来，基于分子学方法的结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（Gene Xpert-MTB/RIF）能够在两小时内直接检测临床标本中的MTB 和RIF 耐药。目前研究显示，Gene Xpert-MTB/RIF 对肺外结核诊断的敏感度可达68.5%，特异度也高达100%［4］。本文通过对肺外结核病患者和非结核性肺外感染病人进行DeFine.TB 和Gene Xpert-MTB/RIF 联合检测，探讨两者联合诊断的意义，为肺外结核的诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018年9月至2020年12月西安交通大学第二附属医院收治的87 例肺外感染患者为临床组研究对象，其中依据临床诊疗指南：结核病分册［5］，临床确诊为肺外结核患者52 例（肺外结核组），其中男32 例，女20 例，平均年龄（53.73±9.22）岁。非结核性肺外感染病人35 例（非结核组）。对肺外结核患者血结核分枝杆菌特异性细胞因子检测（DeFine.TB）、无菌体液DeFine.TB、无菌体液结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（Xpert MTB/RIF）进行检测并分析。

1.2 仪器及试剂

Xpert MTB/RIF 实时荧光PCR 检测仪（美国Cepheid 公司）、Xpert MTB/RIF 检测试剂盒（10 人份/盒，批号：1000083611，美国Cepheid 公司）、结核分枝杆菌特异性细胞因子检测试剂盒Define.TB（28 人份/盒，批号：DM001S20200120，广州迪澳）、酶标仪（深圳雷杜rt-6100）。

1.3 检测方法

1.3.1 血DeFine.TB

将人外周血单个核细胞从全血样本中分离出来，通过计数单个核细胞数量，将定量的单个核细胞与融合蛋白ESAT-6-CFP-10-Rv1985c 在细胞培养板上共培养，检测γ-干扰素及白细胞介素-2 因子浓度，两个因子任意一个因子检测阳性，即判定Define.TB 检测阳性。

1.3.2 无菌体液DeFine.TB

无菌体液包括胸水54 例、腹水29 例和关节液4 例。留取无菌体液10～15 mL 注入到肝素锂抗凝剂的采血管中，及时送检，分别对γ-干扰素及白细胞介素-2 因子进行检测，得到γ-干扰素及白细胞介素-2 因子浓度两个因子任意一个因子检测阳性，即判定Define.TB 检测阳性。

1.3.3 DeFine.TB 结果判读

结果以测定值（T 值）、阴性对照值（N 值）和阳性对照值（P 值）表示。按照产品说明书要求判读阳性结果：γ-干扰素T-N≥7 和/或白细胞介素-2 T-N≥20；阴性结果：γ-干扰素T-N＜7、P-N≥35 且白细胞介素-2 T-N＜20、P-N≥130［6］。

1.3.4 无菌体液Xpert MTB/RIF

常规留取无菌体液，3 000 r/min 离心10 min后，离心半径15 cm，弃去上清，剩余标本中按标本与消化液1∶2 的比例加入消化液。常温静置15 min～1h，待标本完全液化后，取2 mL 标本加入Xpert MTB/RIF 反应试剂盒中，放入Xpert MTB/RIF 实时荧光PCR 检测仪中，2.5 h 后即可得到结核检测结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件进行统计分析；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组三种检测方法的比较

52 例临床确诊为肺外结核的患者中，52 例临床确诊为肺外结核的患者中，血DeFine.TB、无菌体液DeFine.TB 和Xpert MTB/RIF 检测诊断肺外结核总阳性率分别为73.08%（38/52）、94.23%（49/52）和65.38%（34/52）。35 例非肺外结核患者中，血、无菌体液DeFine.TB 和无菌体液Xpert MTB/RIF 检测诊断肺外结核阴性率分别为57.15%、77.14%和100.00%。在诊断肺外结核和非肺外结核感染时，血DeFine.TB γ-干扰素因子单阳和双因子检测差异无统计学意义（P均＞0.05），而无菌体液DeFine.TB双因子阳性和无菌体液Xpert MTB/RIF 差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

表1 两组三种检测方法的比较［n（%）］Table 1 Comparison of three detection methods in two groups［n（%）］

2.2 两种方法单用及DeFine.TB 和无菌体液Xpert-MTB/RIF 联合检测的敏感度和特异度

无菌体液DeFine.TB 敏感度明显高于血DeFine.TB 和无菌体液Xpert-MTB/RIF，而无菌体液Xpert-MTB/RIF 特异度明显高于血和无菌体液DeFine.TB。当无菌体液Xpert-MTB/RIF 和De-Fine.TB 联合检测时，其敏感度和特异度分别为65.38%和100.00%。见表2。

表2 两种方法单用及无菌体液DeFine.TB 和Xpert-MTB/RIF 联合检测性能评估Table 2 Performance evaluation of the two methods alone and the combined detection of Xpert-MTB/RIF and DeFine.TB in sterile body fluids

3 讨论

肺外结核通常由于结核分枝杆菌感染肺部后，经血液或淋巴结播散引起。随着肺外结核发病率逐渐升高，占所有结核病的12.0%～28.5%，而死亡人数占全部结核病死亡人数的14.1%～17.6%［7］。由于肺外结核的感染途径多种多样，可发病于全身的各个部位，所引起的临床症状往往不典型，很多时候会被其他疾病的表现所掩盖，存在误诊或诊断困难等情况［8］。临床上亟需一种快速且有效的检测方法，以达到早期诊断，早期治疗的目的，减轻结核的治疗负担。

DeFine.TB 选取了存在于结核分枝杆菌，但在卡介苗和大多数非结核分枝杆菌中普遍缺失的RD1 区和RD2 区编码的ESAT-6、CFP-10、Rv1985c蛋白。由于方法不受卡介苗的影响，可特异性检测结核分枝杆菌引起的结核病［9-11］。Xpert-MTB/RIF 技术是基于半巢式实时荧光定量核酸扩增技术，针对rpoB基因81bp 利福平耐药核心区间设计6 种分子信标引物、6 种分子探针，检测其是否发生突变，进而用于辅助诊断是否为结核以及是否对利福平耐药的方法，可在2.5h 内快速得出诊断［12］。但DeFine.TB 和Xpert-MTB/RIF 对肺外结核特别是各类型的结核研究较少，对两种诊断方法的价值缺乏统一的认识。

本研究对52 例临床确诊为肺外结核和35 例非肺外结核患者研究发现，在肺外结核组中，无菌体液DeFine.TB 的阳性率明显高于血DeFine.TB和Xpert MTB/RIF 的阳性率。这可能由于DeFine.TB 检测的是无菌体液中特异性T 细胞分泌的γ-干扰素及白细胞介素-2 因子。当感染结核分枝杆菌而导致胸腔或腹腔或关节积液渗出时，感染部位会聚集T 淋巴细胞和B 淋巴细胞。结核特异性T 细胞的数量会明显高于外周血，且无菌体液不同于外周血，没有血液本底的干扰因素。因此，无菌体液DeFine.TB 的阳性率明显高于血DeFine.TB。邹兴武［13］等研究发现，患者高龄、外周血淋巴细胞数量减少、血红蛋白及抗结核治疗均可导致De-Fine.TB 假阴性。因此，DeFine.TB 未能检出所有阳性标本。Xpert-MTB/RIF 检测结核的阳性率低于无菌体液和血DeFine.TB 的阳性率，这可能与无菌体液细菌负荷量偏低有关，但Xpert-MTB/RIF 的阳性率也达到65.38%，说明Xpert-MTB/RIF 对肺外结核的检出有一定效果。这一数据与张新宝等［14］报道相近。非结核组中，血DeFine.TB 的阳性率高于无菌体液DeFine.TB 的阳性率，而Xpert-MTB/RIF未检出阳性。DeFine.TB 出现假阳性可能是由于机体存在一过性感染［15］或与堪萨斯分枝杆菌、海氏分枝杆菌和苏尔加分枝杆菌等存在交叉反应或肿瘤抗原与结核抗原存在表位交叉。Xpert-MTB/RIF 未出现假阳性，与以前的研究结论一致［16-17］。

无菌体液DeFine.TB 在肺外结核组的敏感度最高，血DeFine.TB 和Xpert-MTB/RIF 的敏感度次之。无菌体液Xpert-MTB/RIF 在肺外结核组的特异度最高，无菌体液DeFine.TB 和血DeFine.TB 的特异度依次为77.14%和57.14%。安徽省胸科医院仅对胸腔积液研究表明［18］，胸腔积液DeFine.TB 敏感度97.37%高于血DeFine.TB 76.32%、胸腔积液Xpert-MTB/RIF65.79%，胸腔积液DeFine.TB 特异度77.78% 高于血DeFine.TB 55.56%，低于胸腔积液Xpert-MTB/RIF 特异度100%。本研究中Gene Xpert-MTB/RIF 检测在肺外结核诊断的敏感度为65.38%，特异度为100%，说明在肺外结核诊断过程中，Gene Xpert-MTB/RIF 检测技术具有较高的价值。而且Xpert-MTB/RIF 检测技术仅需要标本含菌量10～100 个/mL［19］。涂盛锦等［20］通过将胸腔积液Xpert-MTB/RIF 浓缩后检测发现阳性率明显高于常规应用Xpert-MTB/RIF 检测胸腔积液，且胸腔积液Xpert-MTB/RIF 特异性更高。说明通过浓缩提高标本含菌量会显著提升Xpert-MTB/RIF的阳性率。本次研究与相关报道接近，且本次研究中Xpert-MTB/RIF 阳性预测值为100%，说明Xpert-MTB/RIF 极具确诊意义。本研究无菌体液DeFine.TB 联合无菌体液Xpert MTB/RIF 方案虽未能进一步提升检测的敏感度，但明显提高了特异度。有研究表明，DeFine.TB 联合分子免疫等检测方法可以提高诊断的敏感度和特异度［21-22］。与本研究中联合检测中特异度结论一致。

综上所述，本研究表明无菌体液DeFine.TB 敏感度更高但特异度稍差，而无菌体液Xpert-MTB/RIF 具有很高的特异度，当两种检测方法联合使用时可明显提高诊断肺外结核的特异度，虽然敏感度也相应减低，但对于初筛病人来说，联合检测可明显提高其阳性和阴性预测值，可为临床早期识别肺外结核与非结核患者、及早抗结核治疗提供参考。