游离DNA保存管中甘氨酸含量的测定方法与应用

魏慧慧 刘艳 殷剑峰 苏丽红★ 王玉梅★

游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）作为新型的医疗诊断标志物，自发现即迅速整合进入肿瘤液态活检、产前遗传诊断等领域，极大地促进了检测技术的发展，成为重要的辅助诊断手段［1-2］。但血液样品在常温储存及运输过程中，有核细胞极易破裂，导致基因组DNA 释放、降解，造成血浆中游离DNA 成分污染及丰度降低。为确保游离DNA 的质量以及后期检测的准确，保存管中必须添加防腐剂、核酸酶抑制剂以及有核细胞保护剂等添加剂［3］。其中，甘氨酸作为一种游离DNA 保护剂，对细胞腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine triphosphate，ATP）耗竭性损伤具有保护作用［4］。但在国家药品监督管理局颁布的现行行业标准中，除了涉及系列抗凝剂的检测［5］，目前尚未形成对甘氨酸等添加剂的标准检测方法。同时，药典中仅有针对药品中甘氨酸含量的检测方法，但不适合作为游离DNA保存管中添加剂的质量评价方法。本研究建立了游离DNA保存管中甘氨酸的定量测定方法，并选用市场上不同厂家的两种保存管进行应用验证，用于游离DNA保存管的质量控制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

TD5 离心机，购自湖南赫西仪器装备有限公司；XSE205DU/81G 电子天平，购自梅特勒托利多公司；日立U-3310 紫外可见分光光度计，购自HITECH 公司；SpectraMax M5 酶标仪，购自Molecular Devices 公司。甘氨酸国家标准品（批号140689-201605，100 mg/支），中国食品药品检定研究院提供；茚三酮，纯度99%，购自Alfa Aesar 公司；丙二醇甲醚，优级纯，购自沃凯化学试剂公司；硼氢化钠，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；三水醋酸钠，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

1.2.1.1 基质液 参照采血管中添加剂含量［5］及市场调研结果，称取5.00 g 咪唑烷基脲、2.50 g EDTA·K2·2H2O，置于同一烧杯，加水溶解后，转入25 mL 容量瓶，定容，配制含200.00 mg/mL 咪唑烷基脲、100.00 mg/mL EDTA·K2·2H2O 的基质溶液。基质液进行50 倍稀释，成稀释液。

1.2.1.2 甘氨酸标准储备液和模拟液 称取甘氨酸标准品75.00 mg，加入25 mL 容量瓶，加水溶解后定容，成甘氨酸标准储备液（40.00 mmoL/L）；称取甘氨酸标准品187.50 mg，加入5 mL 容量瓶，加基质液溶解，并以基质液定容，成甘氨酸模拟液（500.00 mmoL/L）。

1.2.1.3 茚三酮反应液 称取4.00 g 茚三酮溶于95 mL 丙二醇甲醚，溶解后，加入8.10 mg 硼氢化钠（视存放时间加入），搅拌溶解后过滤，加入丙二醇甲醚定容至100 mL，搅匀备用。

1.2.1.4 缓冲溶液 实验用水200 mL，丙二醇甲醚401 mL，冰醋酸123 mL，三水醋酸钠338.40 g，加水定容至1 000 mL。

1.2.2 方法学建立

1.2.2.1 线性 以超纯水对甘氨酸标准储备液（40.00 mmoL/L）进行稀释，配制成0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmoL/L 系列标准溶液。取上述各标准溶液样品1 mL 分别置于25 mL 刻度管，各加水补充至容积为8 mL，然后加入茚三酮和缓冲溶液各1 mL，混合均匀，于100℃水浴上加热15 min，取出迅速冷却至室温，加水至标线，摇匀。静置15 min 后，在570 nm 波长下，以水为空白对照样品，测定系列标准溶液的吸光度。以标准溶液的甘氨酸浓度对其吸光度作直线回归，求得标准曲线的直线回归方程，相关系数（r）应不小于0.99，各点回收率应在85%～115%范围内。

1.2.2.2 检出限与定量限 参考NLSI-EP17-A2 文件［6］，以稀释液作为空白进行40 孔平行测定，根据拟合直线的斜率，求得吸光度对应的浓度，计算结果的平均值XB和标准偏差SDB，按照公式LOB=XB+ 1.645 SDB计算，获得空白限LOB 浓度。根据计算结果，配制接近或高于空白限浓度的低值样本，即LOB～4LOB 范围内4 个样本，分别测定7次，根据拟合直线的方程分别计算低值样本相应浓度的均值¯和标准偏差SDsn，根据公式：/（n1+n2+n3+n4），计算方差的加权平均，从而得到样本测量标准偏差的集合估计SDS。根据公式LOD=LoB+1.645 SDS计算检测限LOD。同时参考LOQ=XB+10SDB以及常规使用浓度范围，获得设定的定量限LOQ 浓度和可接受总体误差目标0.75 mmol/L。分别平行不少于25 次测定设定浓度的检测限和定量限样品，并按照Bias+2 SDs 计算总体误差，以验证LOD 和LOQ。

1.2.2.3 精密度 取甘氨酸标准储备液（40.00 mmoL/L），用水稀释，制备高、中、低浓度精密度样品供试液（浓度分别为8.00、4.00、2.00 mmoL/L），分别平行6 个样品进行测定。根据公式RSD=SD/计算相对标准偏差RSD。

1.2.2.4 准确度和特异性 取模拟液0.18 mL，加入10 mL 刻度管，成理论靶值6.75 mg/支；取0.1 mL，加入5 mL 刻度管，成理论靶值3.75 mg/支。每种模拟样品按照供试品检测方法制备供试液，分别测定3 次，进行回收率的计算，目标设定为85%～115%。

1.2.2.5 供试品中甘氨酸添加量测定 随机抽取两种游离DNA 保存管各1 支（规格均为10 mL。产品技术要求：供试品1 添加剂浓度为4.00～6.00 mg/支，供试品2 添加剂浓度为8.10～9.90 mg/支，偏差均在15%），4 000 rpm（r=16.7 cm）纵向离心5 min。离心后取出，打开胶塞，加水至标称容量（抽吸体积或公称液体容量）后，摇匀成供试液（或稀释至合适的浓度）进行检测，将供试品的吸光度代入直线回归方程，即得供试液的甘氨酸浓度Ct（mmoL/L）。另取2 支采血管，重复以上操作。按下式计算供试品中甘氨酸添加剂的含量。

m=Ct×V×75/1 000

式中：m-采血管中甘氨酸添加剂的含量，单位为毫克（mg）；Ct-供试液的甘氨酸测定浓度，单位为毫摩尔/升（mmoL/L）；V-采血管的标称容量（抽吸体积或公称液体容量），或稀释后定容体积，单位为毫升（mL）。

2 结果

2.1 线性

本方法检测的线性范围确定为0.63～10.00 mmoL/L，在此范围内，线性相关性较好，相关系数r=0.996 6。见图1。

2.2 检测限和定量限

在0.63～10.00 mmoL/L 线性范围内，经计算空白限LOB 为0.80 mmoL/L，检测限LOD 为1.00 mmoL/L，定量限LOQ 为2.00 mmoL/L，总体误差为0.32 mmoL/L。

2.3 精密度

低、中、高（浓度分别为2.00、4.00、8.00 mmoL/L）各6 个样测定结果见表1。

表1 不同浓度样本的精密度检测结果（n=6）Table 1 Precision test results of samples with different concentrations（n=6）

2.4 准确度和特异性

以甘氨酸国家标准品配制的含有常规基质成份的模拟样品，经检测并换算到单支含量，与理论靶值比较，回收率结果均在85%～115%内，与设定的预期目标一致；未发现基质中常规存在的高咪唑烷基脲与EDTA·K2·2H2O 成份对检测结果有明显干扰，方法具有较好的准确性和特异性。见表2。

表2 准确度和特异性检测结果Table 2 Accuracy and specificity test results

2.5 供试品测定

检测两种不同含量（如表3技术要求所示）的供试品，结果均在其产品靶值范围内，符合技术要求规定。见表3。

表3 供试品测定结果Table 3 The test results of the tested products

3 讨论

循环血液游离DNA 作为非侵入性疾病的生物标志物，可直接应用于下游检测，如数字PCR 和高通量测序等［7-9］，是微创诊断、改善疾病监测、临床决策和患者预后的关键［10-11］，相关体外诊断试剂盒也一直是申报的热点，因此，游离DNA 的保存质量对后续的临床检测结果起重要作用［12-14］。目前上市的一次性真空采血管较多，但未查到获批的针对游离DNA 保存的采血管或保存管，意味着目前各医疗检测机构在进行高通量测序或其他使用游离DNA 样本时使用的保存管均处于不被监管的状态，属于监管漏洞。由于没有可参考的针对游离DNA 保存管的评价方法，笔者在接收的检验中，也是发现了企业在制定技术要求时，有的故意回避该项检验，只作为常规采血管进行。

本研究建立了一种基于茚三酮反应的游离DNA 保存管中甘氨酸的定量检测方法，优化后线性范围为0.63～10.00 mmoL/L，满足设定相关系数0.99的要求，且在此范围内，各浓度点回收率在85%～115%范围内；经验证确立该方法的检测限为1.00 mmoL/L，与使用3SDB计算检测限的方法一致。根据大量专利文献及生产厂家的调研，保存液中甘氨酸添加剂浓度为200.00～600.00 mmol/L（15.00～50.00 mg/mL），参考其最佳作用浓度5.00 mmol/L（相当于保存液中250.00 mmol/L），因而，可接受总体误差目标0.75 mmol/L 经评估是合理的，而误差间距-0.32～0.32 mmoL/L 恰好落在误差目标-0.75～0.75 mmoL/L 范围内，因而LOQ 获得验证，确定为2.00 mmoL/L，且能够满足该产品的检测要求。

运用低、中、高3 个浓度验证了方法分析内的精密度，在常规应用浓度范围内，其标准偏差均不大于10%，检测结果重复性较好。以甘氨酸国家标准品配制模拟样品，以加标回收的方法验证了方法的准确度与特异性，回收率结果在85%～115%内，说明方法具有较好的准确性；且基质溶液的存在下，不受常见添加剂干扰测定，特异性较好。同时，以所建立的方法初步用于游离DNA 保存管检测，结果均符合产品技术要求规定。

本方法经过了山东省医疗器械检测中心、江苏康为世纪生物科技股份有限公司、广州阳普医疗科技股份有限公司等多家验证，其线性、准确性、精密度、特异性均符合作为该特殊采血管评价的要求。在验证工作中，由于接触到的是真实的产品，各家添加量的不同，也碰到由于稀释倍数过低，在加热过程出现沉淀析出的现象，影响结果的准确性，因此，实际应用时需要了解产品的添加剂浓度范围，以设计更好的样本处理方案。通过验证，考虑到实际的添加量范围以及使用者设备的响应范围，最终将标准中的线性范围修改为2.00～10.00 mmoL/L，大大提高了检测的准确性。同时，基于该研究成果，笔者起草并申报了医疗器械行业标准中“一次性使用人体静脉血样采集容器中添加剂量第5 部分-甘氨酸”。本标准的制定将统一检测方法，规范行业要求，便于产品质量控制，为采血管的市场监管提供有效的技术支持。