病原宏基因组高通量测序技术质量评价参考品的建立

刘东来 沈舒 田颖新 周海卫 张樱★ 许四宏★

新冠肺炎疫情发生后之所以能快速锁定病原、揭示新型冠状病毒基因组，得益于病原宏基因组高通量测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技术近年来的快速发展和应用［1-2］。相比传统分子诊断技术，mNGS 技术具有更广泛的检测谱，尤其适合临床不明病因感染的辅助诊断。目前，我国mNGS 行业在产品转化速度和临床普及程度两方面均领先国外［1-3］。然而，mNGS 技术现阶段仍存在较多技术问题，且缺乏相关质量控制方法和评价标准，给医疗机构本地化应用带来困扰和挑战［1］。医疗机构为保证mNGS 本地化的有序发展、规范管理及合理使用，有必要进行质量评价或性能确认［2］。国家卫生健康委临床检验中心、中国医学科院北京协和医院以及本课题组均开展过相关研究［3-5］。参考品是mNGS 技术质量评价体系及标准的重要基础。为便于医疗机构更高效地开展mNGS 本地化检测系统的质量评价活动，本研究建立了包含10 种微生物的mNGS 参考品及其使用方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 参考品候选样本

参考品候选样本包括微生物及人源细胞。微生物包括格氏李斯特菌、副流感嗜血杆菌、琼氏不动杆菌、马红球菌、藤黄微球菌、干燥奈瑟菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、嗜肺军团菌及葡萄牙念珠菌等10 种细菌和真菌，由中国食品药品检定研究院保存并提供。人源细胞为Hela 细胞系由深圳华大因源医药科技有限公司提供。

1.1.2 试剂及仪器

微生物培养及鉴定使用全自动细菌鉴定分析系统（型号VITEK2）及配套的微生物鉴定卡均由梅里埃诊断产品（上海）有限公司生产。

参考品前处理使用湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司生产的高效组织细胞样品处理仪（型号NOVAprep DS1000）。核酸定量使用赛默飞世尔公司生产的核酸定量荧光仪（型号Qubit 4）及配套的双链DNA 荧光定量检测试剂盒（Qubit dsDNA HS）。核酸提取纯化的核酸纯化试剂（柱提法），核酸打断使用的核酸酶切反应通用试剂盒，测序文库构建使用的PMseq 感染病原高通量基因检测试剂盒，测序使用的基因测序仪（型号BGISEQ-50）及配套的高通量测序试剂套装（FCL SE50），生物信息学分析使用的病原微生物基因检测软件，均由深圳华大因源医药科技有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 候选样本培养及鉴定

不同微生物选择合适的培养方法，参考本课题组前期报道［6］。

1.2.2 菌株浓度测定

微生物的菌落形成单位（colony forming unit，CFU）浓度使用梯度稀释法进行测定，参考本课题组前期报道［6］。

1.2.3 参考品制备及验证

制备方法参考本课题组前期报道［3，6］，将5 种微生物与人源细胞按不同浓度进行混合：不含微生物、微生物浓度分别为105、104及103CFU/mL，人源细胞均为105cells/mL 的参考品；人源细胞浓度分别为105、104及103cells/mL，微生物浓度均为103CFU/mL 的参考品。

参考品使用方法：阳性符合率和阴性符合率参考品检测1 次；重复性参考品检测3 次，并分别计算各微生物检出序列数的变异系数（coefficient of variation，CV）；检出限和线性参考品检测1 次，并分别计算不同人源细胞和微生物浓度梯度系列参考品中各微生物检出序列数的线性相关系数的绝对值|r|。

1.2.4 参考品稳定性研究

参考品置于室温条件（约25℃）2 次冻融后进行检测，与正常储存（低于-70℃）的参考品的检测结果进行比较，研究冻融稳定性。

1.3 统计学方法

重复性中，用3 次重复检测结果中各微生物检出序列数的标准差（SD）除以平均值（），计算变异系数CV。线性中，3 个浓度水平样本检测结果中各微生物检出序列数和浓度梯度比例用最小二乘法进行直线拟合，计算线性相关系数r。

2 结果

2.1 参考品组成

空白参考品D0 以及分别含有5 种微生物的D1 和D2 系列参考品组成见表1。

表1 病原宏基因组高通量测序技术质量评价参考品组成Table 1 Composition of reference panel for quality evaluation of pathogen metagenomic next-generation sequencing

2.2 参考品验证结果

使用病原宏基因组高通量测序技术检测制备好的参考品，参考品范围内的微生物均检出。见表2。

表2 参考品病原宏基因组高通量测序检测结果Table 2 Results of detection of reference panel by pathogen metagenomic next-generation sequencing

参考品D1-2 和D2-2 各个微生物3 次检测的检出序列数的变异系数均小于50%，其中7 个微生物的变异系数小于30%，见表3。参考品D1-1、D1-2 和D1-3，D1-3、D1-2（10）和D1-1（100），D2-1、D2-2 和D2-3，以及D2-3、D2-2（10）和D2-1（100）各个微生物检出序列数的线性相关系数的绝对值|r|均大于0.86。见表3。

表3 变异系数及线性相关系数计算结果Table 3 Calculation results of coefficient of variation and linear correlation coefficient

2.3 参考品稳定性

分别对未冻融和冻融过的参考品D1-3和D2-3进行检测，未冻融和冻融1 次时各微生物检出序列数未见明显差异，冻融2 次后检出序列数均下降。见表4。因此，冻融2 次的参考品不宜继续使用。

表4 参考品冻融稳定性研究结果Table 4 Results of study on freeze-thaw stability of reference panel

3 讨论

mNGS 技术对于新发病原体感染、复杂及混合感染以及不明原因感染的诊断独具优势［1，7-14］。2021年2月，国家药品监督管理局修订《医疗器械监督管理条例》，规定“对国内尚无同品种产品上市的体外诊断试剂，符合条件的医疗机构根据本单位的临床需要，可以自行研制，在执业医师指导下在本单位内使用”；2021年7月，《中共中央国务院关于支持浦东新区高水平改革开放打造社会主义现代化建设引领区的意见》，提出“允许有条件的医疗机构按照相关要求开展自行研制体外诊断试剂试点”。技术优势和政策支持正推动mNGS技术开启医疗机构本地化建设的新篇章［2］。然而，mNGS 检测流程对环境、仪器及人员专业技术能力要求极高，医疗机构在正式开展mNGS 本地化检测前需要进行质量评价［2，5］。尽管已有多个研究团队报道过相关研究，但仍未建立公认的适合于医疗机构的本地化质量评价模式或方案［3-5，15］。

本参考品的微生物选择原则和使用方法是对以往研究的继承和创新［3-6，10］。微生物选择原则包括：①参考品组成包括人源细胞和微生物，可以模拟临床感染样本。②mNGS 检测范围理论覆盖其生物信息学分析流程中使用数据库里面的全部病原体，全部验证不具有可操性，因此常选择少数几种进行验证。③参考品中含有较高浓度微生物，且进行质量评价时在短期内需完成大量检测，存在气溶胶污染风险。④选择临床不常见、但与临床常见微生物种属相近的物种进行“代表性”验证，可以最大程度不干扰医疗机构日常检验工作。⑤通过考察检测结果中，是否将参考品中临床不常见微生物误报为其近缘的临床微生物，来评价检测的准确性和特异性（即假阳性）。⑥通过设置仅含人源细胞、不含微生物的空白参考品，可以对整体的检测结果情况进行校正。

本参考品使用方法：①以往研究提示人源细胞背景对mNGS 检出限有潜在影响［1-5］，本参考品通过设置3 种人源细胞水平，可以清晰地看到，微生物检出序列数随着人源细胞浓度增加而降低，提示高浓度的人源细胞有可能影响mNGS 的检出限。②通过检测“固定人源细胞-微生物梯度降低”和“固定微生物-人源细胞梯度降低”两组参考品，并计算各微生物检出序列数的线性相关系数，可以分析检测的稳定性（即鲁棒性）。③仅用15 个测试，即可快速高效地对阳性符合率、阴性符合率、重复性、检出限及线性等性能指标进行评价。

综上所述，本课题组建立了病原宏基因组高通量测序技术质量评价参考品及使用方法，包括1 个空白和10 个微生物参考品。使用该参考品，本课题组联合几十家医院，于2021年开展了全国医疗机构mNGS 本地化质量评价联合研究（数据整理分析中），以期为医疗机构开展mNGS 本地化建设提供支持。