淫羊藿-川芎药对HPLC指纹图谱建立与骨关节炎的谱效关系研究

陈文钧， 骆 媱， 章建华， 尹 华*

(1.浙江中医药大学药学院中药标准化研究实验室，浙江 杭州 311402；2.浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州 310006)

骨关节炎是一种以关节软骨退行性病变为核心，累及骨质并包括滑膜、关节囊及关节其他结构的慢性炎症[1-2]。骨关节炎属中医“骨痹”范畴，临床多采用补肾活血方药治疗。淫羊藿-川芎药对取自《太平圣惠方》中的仙灵脾散，由淫羊藿、川芎、威灵仙、肉桂、苍耳子组成，取淫羊藿补肾阳、强筋骨之功，川芎活血行气、祛风止痛之效，两药合用可标本兼治。中医骨伤科临床诊治骨关节炎时，常以淫羊藿、川芎配伍使用，再随证加减其他药味，疗效显著。研究表明，淫羊藿苷可调控软骨细胞代谢，促进滑膜细胞增殖，抑制MMP-13、MMP-3、IL-1β、PGE2表达，从而延缓骨关节炎的发展[3-5]；川芎可改善外周血管循环，抑制血小板聚集，改善炎症[6-7]。

本研究采用HPLC法建立22批淫羊藿-川芎药对指纹图谱，酶联免疫法检测MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平，应用双变量相关分析、灰色关联度分析和遗传神经网络研究其谱-效关系，初步阐明该药对治疗骨关节炎的物质基础。

1 材料

1.1 仪器 Waters alliancee 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司，配置e2695分离模块、柱温箱、2998PDA检测器、Empower色谱工作站)；MettlerXS105电子天平(十万分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；BP211D电子分析天平(德国赛多利斯公司)；Centrifuge 5804R高速冷冻离心机、手动移液器(德国Eppendorf公司)；KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；Biorad 680全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)；Ti-S正置显微镜(日本Nikon公司)。

1.2 试剂与药物 淫羊藿、川芎饮片共22批，具体信息见表1～2，经浙江中医药大学药学院中药鉴定教研室鉴定为正品，编号S1～S22。硫酸氨基葡萄糖胶囊购自永信药品工业(昆山)股份有限公司，批号GSCyK004；塞来昔布胶囊购自美国Pfizer公司，批号W64712。绿原酸购自中国食品药品检定研究院，纯度均>98%，批号0753-200111；阿魏酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、藁本内酯对照品购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均>98%，批号B20007、B20170、B20172、B20173、B21576、B20075、B20492；洋川芎内酯I、洋川芎内酯A购自成都克洛玛生物科技有限公司，纯度均>98%，批号CHB180617、CHB180615。MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司，批号MM-O11OR1、MM-0112R1、MM-0047R1、MM-20607R1、MM-0068R1。乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

表1 淫羊藿饮片信息

表2 川芎饮片信息

1.3 动物 清洁级SD大鼠，雌雄各半，体质量180～220 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可号SCXK(沪)2017-0005，饲养于浙江中医药大学动物实验中心屏障系统内。

2 方法与结果

2.1 HPLC指纹图谱建立

2.1.1 色谱条件 按照文献[8-9]报道，Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱，程序见表3；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长275 nm；进样量10 μL。

表3 梯度洗脱程序

2.1.2 溶液制备

2.1.2.1 供试品溶液 精密称取淫羊藿(批号180101)、川芎(批号171201)饮片粉末各0.2 g(过40目筛)，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入80倍量50%乙醇，称定质量，在40 ℃下超声处理30 min，冷却至室温，50%乙醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，12 000 r/min离心15 min，取上清液，即得。

2.1.2.2 对照品溶液 精密称取绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯适量，置于10 mL量瓶中，甲醇制成质量浓度为2.255、2.330、2.167、2.041、2.042、2.327、2.173、2.112、2.261、2.049 mg/mL的溶液，即得。

2.1.3 方法学考察 以朝藿定C(11号峰)为参照峰，取同一供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得各成分色谱峰相对保留时间RSD均<1.7%，相对峰面积均RSD<2.8%，表明仪器精密度良好。按“2.1.2.1”项下方法制备供试品溶液6份，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得各成分色谱峰相对保留时间RSD均<0.1%，相对峰面积RSD均<2.9%，表明该方法重复性良好。取同一供试品溶液，于0、2、4、8、12 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得各成分色谱峰相对保留时间RSD均<1.2%，相对峰面积RSD均<2.9%，表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.4 图谱生成 按“2.1.2.1”项下方法制备22批药对的供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统建立指纹图谱，共确定20个共有峰，见图1，再采用SPSS 17.0软件，以共有峰峰面积为变量，将22批次饮片分为7类，见图2。最终，选取S3、S19、S12、S21进行后续药效学研究。

注：S2为淫羊藿对照图谱，S3为川芎对照图谱，S4为对照品溶液。1.绿原酸 5.阿魏酸 8.洋川芎内酯Ⅰ 9.朝藿定A 10.朝藿定B 11.朝藿定C 12.淫羊藿苷 17.宝藿苷Ⅰ 18.洋川芎内酯A 19.藁本内酯图1 22批药对HPLC指纹图谱

图2 22批药对聚类分析图

2.2 药效学研究

2.2.1 造模与给药 56只大鼠适应性饲养1周后，分为正常组(8只)和造模组(48只)，造模组大鼠采用切断前交叉韧带并损伤半月板法建立骨关节炎模型，术后每天腹腔注射青霉素40 000 U/只，连续3 d，以预防感染。

图2显示，22批药对分为7类，其中S16、S11、S20这3批饮片单独成类，样本量较少，无可比性，故选取其他4类中的各1批。将造模组大鼠随机分为模型组，淫羊藿-川芎药对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，阳性药组，每组8只，雌雄分笼饲养，正常饮水摄食。

造模3 d后，淫羊藿-川芎药对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组大鼠分别灌胃给予2 g/mL药液，阳性药物组大鼠灌胃给予2 mg/mL塞来昔布、12.5 mg/mL硫酸氨基葡萄糖溶液，剂量均为1 mL/100 g；正常组、模型组大鼠灌胃给予等体积蒸馏水。

2.2.2 淫羊藿-川芎药对对骨关节炎大鼠血浆中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平的影响 给药8周后，大鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥(0.15 mL/100 g)麻醉，心脏取血，4 ℃、3 000 r/min离心20 min，分离血浆，按酶联免疫检测试剂盒说明书操作，检测血浆中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平，结果见表4。由此可知，与正常组比较，模型组大鼠血浆中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平升高(P<0.01)；与模型组比较，各淫羊藿-川芎药对组和阳性药组大鼠血浆中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平降低(P<0.05，P<0.01)。

表4 淫羊藿-川芎药对对大鼠血浆中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平的影响

2.3 谱效关系研究 以20个共有峰峰面积为X，MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平分别为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，将数据进行归一化处理后，采用双变量相关分析、灰色关联度分析、遗传神经网络[10-13]进行分析，结果见表5。双变量相关分析得出，1(绿原酸)、9(朝藿定A)、10(朝藿定B)、17(宝藿苷Ⅰ)号峰对抑制MMPs(MMP-13、MMP-3)水平的贡献较大，5(阿魏酸)、10(朝藿定B)、18(洋川芎内酯A)号峰对抑制炎性因子(IL-1β、NO、PGE2)水平的贡献较大；灰色关联度分析得出，2、11(朝藿定C)、12(淫羊藿苷)号峰与MMPs关联度大于0.7，说明这3种成分对抑制MMPs表达的贡献较大，而其他共有峰均在0.6～0.7之间；遗传神经网络分析得出，9(朝藿定A)、16、12(淫羊藿苷)、13号峰对抑制MMPs表达贡献较大，3、6、10(朝藿定B)、15、2号峰对抑制炎性因子的表达贡献较大。3种分析方法表明，抑制MMPs表达贡献较大的为1(绿原酸)、2、9(朝藿定A)、10(朝藿定B)、11(朝藿定C)、12(淫羊藿苷)、13、16、17(宝藿苷Ⅰ)号峰，均为淫羊藿成分；抑制炎性因子贡献较大的为2、3、5(阿魏酸)、6、10(朝藿定B)、15、18(洋川芎内酯A)号峰，均为淫羊藿-川芎药对成分。

表5 相关系数测定结果

3 讨论

本研究考察提取方式(超声、回流)、提取时间(15、30、45、60 min)、溶剂倍数(40、80、100、120、150、200倍)、浸泡时间(0、0.5、1、2 h)等，以绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯10个成分的提取率、色谱峰响应及分离情况为评价指标，确定供试品溶液的制备方法。

骨关节炎的发病机制有基质金属蛋白酶、炎性因子和一氧化氮学说等。基质金属蛋白酶过表达会导致软骨退化，MMP-13是作用于软骨降解的主要酶[14-15]；IL-1β是促使软骨代谢平衡转向分解和退化的细胞因子之一，诱导滑膜和软骨产生MMPs等蛋白水解酶造成软骨基质的降解破坏；PGE2参与全身的炎症反应，导致软骨下骨的吸收，影响骨与软骨合成代谢，并通过细胞间cAMP的积累诱导软骨细胞凋亡[16-17]；炎性介质导致NO合成增多，导致滑膜、软骨的氧化损伤。选择MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2进行药效评价，可客观准确地评价淫羊藿-川芎药对对骨关节炎的治疗作用。4批淫羊藿-川芎药对、阳性药给药后，骨关节炎大鼠血浆中各指标含量均下降，说明淫羊藿-川芎药对对骨关节炎确切有效。

采用3种统计方法联用并进行交叉验证，结果更准确。结果显示，淫羊藿中1(绿原酸)、2、9(朝藿定A)、10(朝藿定B)、11(朝藿定C)、12(淫羊藿苷)、13、16、17(宝藿苷Ⅰ)号峰对抑制MMPs表达贡献较大，淫羊藿-川芎药对中2、3、5(阿魏酸)、6、10(朝藿定B)、15、18(洋川芎内酯A)号峰抑制炎性因子贡献较大。综上所述，淫羊藿对抑制MMPs表达贡献较大，而抑制炎性因子的表达是淫羊藿-川芎药对协同作用的结果，初步阐明了淫羊藿-川芎药对治疗骨关节炎的物质基础。