HPLC法同时测定细叶亚菊中绿原酸和异绿原酸A的含量

2020-12-21裴荣冠林鹏程

西北民族大学学报（自然科学版） 2020年4期

裴荣冠,林鹏程

(1.青海民族大学药学院，青海西宁 810007；2.青海省药物分析重点实验室，青海西宁 810007；3.青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室，青海西宁 810007)

细叶亚菊(Ajaniatenuifolia(Jacq.) Tzvel)菊科，亚菊属,为多年生草本植物，主要分布在青海、四川西北部、西藏东部海拔2 000～4 580米处[1].菊科植物一般富含黄酮和酚酸类成分[2-3]，可通过HPLC-MS进行鉴定.细叶亚菊中含有金丝桃苷、槲皮素、异槲皮素苷、木犀草素、新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B等成分[3].其中绿原酸和异绿原酸A是细叶亚菊的主要化学成分.绿原酸和异绿原酸A具有良好的药理活性.绿原酸具有心血管保护、抗诱变、抗癌、抗白血病、抗菌及抗病毒作用，还能降脂、免疫调节、降糖等[4-7].异绿原酸A可抑制白细胞迁移和炎症过程超氧阴离子的产生，具有良好的体外抗炎作用[8-9].目前，细叶亚菊中绿原酸的含量已由薛敬[10]等测定为9.457 mg/g，细叶亚菊异绿原酸A尚未建立测定方法.笔者在此基础上进行改进，建立了HPLC法同时测定细叶亚菊中绿原酸和异绿原酸A含量的方法[11-12].该方法准确、简便，可用于细叶亚菊中绿原酸和异绿原酸A含量的同时测定.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器

Aglient1200型高效液相色谱仪， METTLER AL204电子天平，昆山洁力美超声仪器有限公司(KQ-800E)超声波清洗器.

1.1.2 试验材料

绿原酸对照品(四川省维克奇生物科技有限公司,批号wkq19010201)；异绿原酸A对照品(四川省维克奇生物科技有限公司,批号wkq19022505);乙腈(山东禹王和天下新材料有限公司)；磷酸(天津市河东区红岩试剂厂)均为色谱纯；水为实验室自制超纯水.细叶亚菊采于青海省贵德江拉林场,经青海民族大学林鹏程教授鉴定为菊科亚菊属细叶亚菊.

1.2 方法与结果

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm 5 μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(19︰81)；流速为1 mL/min;柱温30 ℃;检测波长330 nm;样品进样量10 μL.该色谱条件下绿原酸和异绿原酸A可达到基线分离.

1.2.2 溶液配制

供试液的制备:取细叶亚菊粉末1 .0 g，加甲醇50 mL，超声提取1 h，提取两次.合并滤液，甲醇补足，定容50 mL容量瓶中，即得供试液.

对照品溶液制备:取绿原酸和异绿原酸A对照品1.0 mg，精密称定，加甲醇制成1 mL含50 μg的溶液.

1.2.3 样品的测定

取上述对照品、供试品溶液各 10 μL，在“1.2.1”色谱条件下分别注入液相色谱仪，色谱图见图1.

1.2.4 线性关系

精密吸取异绿原酸A对照品溶液1、2、4、8、10、16 μL，以峰面积(Y)对进样量(μg)进行线性回归，得绿原酸回归方程为Y= 39.673X + 15.788，r=0.998 4，异绿原酸A回归方程为Y= 147.79X- 5.8167，r=0.999 8.结果表明，绿原酸和异绿原酸A进样量在0.05～0.8 μg的范围内有良好的线性关系(见图2).

1.2.5 精密度试验

取绿原酸和异绿原酸A对照品溶液，记录其峰面积(Y)，测得绿原酸和异绿原酸A的峰面积的RSD分别为0.4%、0.32%(n=6)，说明该仪器精密度良好，结果见图1.

图1细叶亚菊供试品图2绿原酸和异绿原酸A

1.2.6 稳定性试验

取供试品溶液，以“1.2.1”项色谱条件取同一份供试品溶液，室温下分别在0、2、4、8、12 h进样测定，绿原酸和异绿原酸A平均含量的RSD分别为0.32%、0.34%.结果表明，供试品溶液在室温下12 h内稳定.

1.2.7 重复性试验

取同一批号样品6份，每份约1 g，精密称定，于“1.2.1”项色谱条件下进样，测定峰面积(Y)，计算绿原酸和异绿原酸A的平均含量分别为8.37 mg/g、 5.51 mg/g，RSD为0.40%、0.15%.结果表明,本方法重复性良好,见表1.

1.2.8 回收率试验

分别精密称取样品6份(每份约1.0 g)，加标量为所测含量的1倍，绿原酸的平均回收率为98.46%，异绿原酸A的平均回收率为99.52%.

表1 异绿原酸A加样回收率试验结果(n=6)

1.2.9 样品的测定

在“1.2.1和1.2.2”项的色谱条件下测得细叶亚菊中绿原酸含量为8.37 mg/g，RSD为0.40%(n=6)，异绿原酸A的含量为5.51 mg/g,RSD为0.15%(n=6).

2 讨论

2.1 波长选择

通过对绿原酸和异绿原酸A的全波谱扫描及相关文献查询[8,11-12]，绿原酸和异绿原酸A最大吸收波长为330 nm(见图3、图4),故选取330 nm作为紫外检测器检测波长.

图3 绿原酸光谱扫描图图4 异绿原酸A光谱扫描图

2.2 提取溶剂选择

绿原酸和异绿原酸A母核结构由咖啡酰与奎尼酸构成，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个不稳定部分，不易进行热提取.绿原酸和异绿原酸A难溶于水，可溶于有机试剂，且细叶亚菊中含有大量黄酮[3].大量的黄酮会影响绿原酸和异绿原酸A含量的测定，故未选取不同浓度的乙醇进行提取[10].又因甲醇较为廉价且毒性较低，故选取甲醇为提取溶剂.