江南星蕨中原儿茶酸、5-羟甲基-2-呋喃甲醛对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

2022-06-15李善斌黄四新牟俊飞梁成钦周先丽

中成药 2022年5期

李善斌，黄四新，牟俊飞，罗琴，梁成钦，周先丽*

(1.桂林医学院生物技术学院，广西桂林 541004；2.桂林医学院药学院，广西桂林 541004)

随着人们生活水平的提高，糖尿病患者迅速增加，特别是广大发展中国家[1]。在已知的疾病中糖尿病死亡率高居第3位，仅次于肿瘤和心脑血管疾病[2]。全球约有4.25亿糖尿病患者，而我国拥有数量世界第二的糖尿病患者[3-4]，大多数为2型糖尿病。对于2型糖尿病患者，控制餐后血糖可以有效的防止一系列糖尿病症的发生[5]。

葡萄糖苷酶在生物体内主要是通过水解糖类中的葡萄糖苷键生成葡萄糖，葡萄糖苷酶对于调节餐后血糖具有决定性作用，按照其功能分为α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶[6]。目前临床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂(AGIs)，例如阿卡波糖、米格列醇等[7]，AGIs本身存在一定毒副作用，因此，从天然植物中开发新型、高效、低毒的AGIs对于2型糖尿病的防治具有重要意义[8]。

江南星蕨Microsorumfortunei为水龙骨科植物，用于疔毒、蛇虫咬伤、烧伤等症[9-10]，江南星蕨含有糖、酚酸、黄酮等多种活性成分[11]，同时还具有较强的抗菌和抗氧化活性[12-14]，但目前对于其中α-葡萄糖苷酶抑制活性的报道较少。本研究对该药材中原儿茶酸、5-羟甲基-2-呋喃甲醛对α-葡萄糖苷酶抑制活性进行研究，以期为其进一步开发利用提供依据。

1 材料

1.1 药材与试剂江南星蕨采于广西资源县，经桂林医学院李云秋教授鉴定为正品。阿卡波糖(上海梯希爱化成工业发展有限公司)；二甲基亚砜(西陇科学股份有限公司，批号1709101)；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(美国Sigma公司)。

1.2 仪器酶标仪(美国Bio-Teck公司)；FE28 PH计、电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；微量移液器(德国Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 化合物提取分离参照文献[3]报道，江南星蕨干燥粉碎后用75%乙醇提取1 h，重复2次，乙酸乙酯萃取后正丁醇萃取，得到2个组分，经硅胶柱层析，分别得到组分Fr.A～Fr.F、Fr.I～Fr.Ⅵ。Fr.B经MCI柱，90%甲醇洗脱，Sephadex LH-20柱分离，得到组分Fr.B.1～Fr.B.5，Fr.B.4经中压反相硅胶柱色谱分离，10%～100%甲醇洗脱，得到原儿茶酸。再采用MCI柱分离Fr.Ⅱ组分，甲醇洗脱，得到组分Fr.Ⅱ.1～Fr.Ⅱ.4，Fr.Ⅱ.1经反相硅胶柱、RP-HPLC制备色谱分离，得到5-羟甲基-2-呋喃甲醛。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定反应体系参照文献[15]，以阿卡波糖为阳性对照，2个化合物用DMSO溶解后以pH 6.9的磷酸盐缓冲液稀释至0.001、0.010、0.050、0.100、0.200、0.500 mg/mL，分别取50 μL至96孔板中，加入100 μL 0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶混匀，置于25 ℃孵育箱中15 min，加入50 μL 5 mmol/L pNPG，在25 ℃下孵育10 min，在405 nm波长处测定吸光度(A)，计算酶活性抑制率，公式为抑制率=[(A0-A1)/A0]×100%，其中A0为空白组吸光度，A1为样品组吸光度。

2.3 酶抑制动力学研究参考文献[16]报道，设置化合物质量浓度为0.5 mg/mL，测定在反应时间1、5、10、15、20 min时化合物在反应时间对酶活性的影响。在化合物质量浓度分别为0、0.5 mg/mL时，改变α-葡萄糖苷酶浓度为0.24、0.36、0.48、0.60 U/mL，测定α-葡萄糖苷酶抑制活性，并判断其抑制作用的可逆性[17]。取0.5、1、1.7、2 mmol/L pNPG与不同质量浓度2个化合物，测定反应速率，绘制化合物的Lineweaver Burk酶抑制动力学曲线，确定抑制作用类型[18]。

3 结果

3.1 化合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用由图1可知，原儿茶酸、5-羟甲基-2-呋喃甲醛有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制率与质量浓度呈正相关，两者和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率分别为55.46%、68.77%、91.72%，其IC50值分别为(0.090±0.029)、(0.002±0)、(0.105±0.013)mg/mL。

图1 各化合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率

图2 各化合物反应时间-酶活性曲线

3.2 酶抑制动力学由图2可知，2个化合物质量浓度在0.5 mg/mL时，酶活性抑制率在1 min内达到峰值，随后下降。由图3～5可知，随着抑制浓度增加，2个化合物、阿卡波糖直线斜率逐渐减小，表明酶活力降低是由于酶活力受到影响，与酶量减少无关，即三者均为可逆性抑制。由图6～8可知，反应体系中改变抑制剂浓度基本上没有改变Vmax，表明2个化合物、阿卡波糖对酶均呈现竞争性抑制。