淫羊藿苷通过抑制Nod样受体家族蛋白3炎症小体相关蛋白表达抑制BV2小胶质细胞炎症反应

郑层层，杨翠翠，郜 丹，郝晋萍，张 兰，胡朝英

（首都医科大学宣武医院药学部，北京市神经药物工程研究中心，北京 100053）

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种主要累及中枢神经系统（central nervous system，CNS）白质的自身免疫性疾病，以慢性炎症浸润、脱髓鞘以及CNS轴突和神经元丢失为主要病理特征[1]，临床表现具有症状和体征的空间多发性、病程的时间多发性及复发、迁延和致残率高等特点，多发于视神经、脊髓和脑干。目前，MS已成为致青壮年肢体残疾的第二大诱因，给家庭和社会造成沉重的经济和心理负担[2-4]。MS发病初期多为复发缓解型，多以抑制炎性脱髓鞘病变进展、防止急性期病变恶化及缓解期复发为主要治疗方针，有限的药物选择和沉重的治疗负担是治疗MS面临的两大难题。

神经系统和免疫系统之间存在多维度的交互作用[5-6]。在MS炎症反应早期，小胶质细胞在维持CNS免疫微环境稳态的过程中占主导地位[7]。小胶质细胞作为CNS固有免疫细胞以及联接固有免疫和获得性免疫的桥梁，是CNS最主要的免疫防线。对于内、外源性刺激，小胶质细胞首先被激活并分泌一系列炎症细胞因子和神经毒性因子，这些因子可能导致邻近神经元受损，进而引发更多小胶质细胞激活[7]。此外，小胶质细胞的低水平持续激活，持续释放多种炎症介质，被认为与复发缓解型MS脑和脊髓的持续慢性损伤有关[8-10]。因此，小胶质细胞是治疗MS，尤其是复发缓解型MS的重要靶点。

在CNS中，Nod样受体家族蛋白3（Nod-like receptor family protein 3，NLRP3）炎症小体主要表达于小胶质细胞，被认为是CNS免疫炎症反应的启动子，是控制CNS免疫炎症反应的新靶点[11-12]。小胶质细胞中NLRP3炎症小体的异常过度激活可促进细胞因子白细胞介素1β（interlukin-1β，IL-1β）和IL-18的分泌并促进炎症反应发生，引起细胞凋亡[13-15]。据报道，敲除小胶质细胞内NLRP3炎症小体主要组成蛋白，可减轻CNS炎症[16]。在实验性变态反应性脑脊髓炎模型小鼠中，小胶质细胞NLRP3炎症小体缺失可延缓MS进程，也提示NLRP3炎症小体的激活参与MS进程[17]。

淫羊藿苷（icariin，ICA）是从淫羊藿中提取的黄酮类化合物，具有多种药理学作用，如抗衰老、抗氧化和抗炎作用[18]，且可通过血脑屏障[19]。本课题组前期研究结果表明，ICA能够明显抑制MS模型小鼠小胶质细胞的过度活化，抑制炎症因子分泌[20-21]，但其作用机制尚不明确。本研究进一步探讨ICA的抗神经炎症作用是否与其抑制NLRP3炎症小体的形成有关。

1 材料与方法

1.1 药物、细胞、试剂和仪器

ICA（ID：E065-N15W，批号：110737-201516，HPLC纯度≥94.2%，中国食品药品检验研究院）。小鼠BV2小胶质细胞（批号：3111C0001CCC00-0063，中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心）。DMEM高糖培养基、4%细胞固定液和PBS（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；青、链霉素混合液和ECL化学发光底物（美国Thermo Fisher公司）；细菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（美国Sigma公司）；干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）和Luminex多因子检测试剂盒（美国R&D Systems公司）；大鼠抗人CD16/CD32单克隆抗体和兔抗人CD206多克隆抗体（美国Abcam公司）；Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG（H+L）和Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG（H+L）多克隆抗体（美国Invitrogen公司）；兔抗小鼠NLRP3单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；小鼠抗人凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）、胱天蛋白酶1（caspase 1）和胱天蛋白酶原1（procaspase 1）单克隆抗体（美国Santa公司）；小鼠抗人GAPDH单克隆抗体（中国Abclonal公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）和山羊抗小鼠IgG（H+L）多克隆抗体、DAPI封片剂、山羊血清和Triton X-100（北京中杉金桥公司）。Multiskan Spectrum全波长酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；Bio-Plex 200自动免疫分析仪系统（美国Bio-Rad公司）；Tanon曝光仪（上海天能科技有限公司）；荧光显微镜（日本Nikon公司）。

1.2 细胞培养、分组和药物处理

小鼠BV2细胞用含有10%胎牛血清和1.0%青、链霉素混合液配制的DMEM高糖培养基于37℃、5% CO2和饱和湿度培养箱中培养。将生长良好的BV2细胞悬液以3×107L-1接种于6孔培养板，或以2×107L-1接种于放有灭菌盖玻片的24孔板中。BV2细胞生长至约70%融合度时，用LPS联合IFN-γ诱导BV2细胞，构建拟神经炎症反应的小胶质细胞（microglia with analog neuroinflammation，MANF）模型。BV2细胞分为6组：细胞对照、ICA 10 μmol·L-1、模型及模型+ICA 5，10和20 μmol·L-1组。细胞对照和模型组加入DMEM高糖培养基，ICA组加入ICA 10 μmol·L-1，模型+ICA组分别加入ICA 5，10和20 μmol·L-1，孵育24 h；随后模型和模型+ICA组加入LPS 100 μg·L-1和IFN-γ 20 μg·L-1，细胞对照和ICA组用等体积培养基代替，孵育18 h；最后模型+ICA组加入相应浓度的ICA，其他各组加入等体积培养基，继续孵育24 h。处理结束后，吸取24孔板细胞上清进行Luminex多细胞因子检测，固定细胞后进行免疫荧光染色；提取6孔板细胞蛋白质进行Western印迹实验。

1.3 Luminex多细胞因子试剂盒检测细胞培养上清中lL-3，lL-5，lL-17和单核/巨噬细胞趋化因子11（monocyte/macrophage chemokine 11，CCL11）浓度

收集1.2中24孔板细胞上清液，每组4复孔，低温离心去除细胞颗粒备用。试剂盒平衡至室温，按使用说明书依次向微孔板中加入样品或标准品、蛋白微粒混合物、生物素-抗体检测试剂、链霉亲和素-PE制剂和洗涤缓冲液，室温摇床30 min。将微孔板置于磁力架上，清洗液清洗3次，每孔加入洗涤缓冲液100 μL，使微粒重新悬浮，在摇床上培养2 min。用Bio-Plex 200自动免疫分析仪检测细胞上清液中IL-3，IL-5，IL-17和CCL11浓度。

1.4 免疫荧光染色检测BV2细胞M1型和M2型细胞百分比

收集1.2中24孔板细胞，每组3复孔，加4%细胞固定液室温固定30 min，PBS洗涤3次，每次5 min；采用0.5% Triton X-100磷酸盐缓冲液（PBST）室温透膜 20 min，PBS 洗涤 3次，每次5 min；5%山羊血清37℃封闭30 min；加入大鼠抗人CD16/CD32单克隆抗体和兔抗人CD206多克隆抗体（稀释比1∶200）4℃孵育过夜；PBS洗涤3次，每次5 min；加Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG（H+L）或Alexa Fluor 594山羊抗兔 IgG（H+L）多克隆抗体（稀释比1∶200）37℃孵育1 h；PBS洗涤3次，每次5 min，DAPI封片剂封片，拍照。绿色荧光表示CD16/CD32阳性，即M1型BV2细胞；红色荧光表示CD206阳性，即M2型BV2细胞。蓝色表示细胞核，即总细胞数。以绿色或红色与蓝色共标的细胞数除以蓝色细胞总数计算M1型或M2型BV2细胞百分比。

1.5 Western印迹法检测BV2细胞NLRP3炎症小体相关蛋白表达

收集1.2中6孔板细胞，每组3复孔，加入RIPA裂解液（含1%苯甲基磺酰氟和2%蛋白酶抑制剂）冰上裂解细胞，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。10%和15% SDS-PAGE凝胶电泳，恒流400 mA转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温摇床封闭1 h，加入兔抗小鼠NLRP3蛋白（1∶1500）、小鼠抗人ASC（1∶500）、小鼠抗人胱天蛋白酶1（1∶500）和小鼠抗人GAPDH（1∶5000）单克隆抗体，4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次8 min；加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）和山羊抗小鼠IgG（H+L）多克隆抗体（二抗，1∶2000）室温孵育1 h。TBST洗涤3次，每次8 min，加入发光液，曝光。以待测蛋白与内参蛋白GAPDH条带积分吸光度比值表示待测蛋白相对表达水平。

1.6 统计学分析

实验结果数据以±s表示，采用SPSS 22和GraphPad Prism 8.0软件进行数据处理和统计学分析。免疫荧光染色结果采用Image J软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD检验。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 lCA对MANF模型炎症因子分泌的影响

如表1所示，与细胞对照组相比，ICA组细胞上清中IL-3，IL-5，IL-17和CCL11水平无明显变化，模型组均显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，模型+ICA 5 μmol·L-1组上述细胞因子水平无明显变化；模型+ICA 10 μmol·L-1组除IL-5降低（P＜0.05）外，其他均无明显变化；模型+ICA 20 μmol·L-1组上述细胞因子水平均显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.1 Effect of icariin（lCA）on secretion of interlukin-3（lL-3），lL-5，lL-17 and monocyte/macrophage chemokine 11（CCL11）in microglia with analog neuroinflammation（MANF）model

2.2 lCA对MANF模型M1和M2型细胞百分比的影响

图1结果显示，与细胞对照组相比，ICA组CD16/CD32和CD206阳性细胞百分比无明显变化；模型组CD16/CD32阳性细胞百分比明显增加（P＜0.01），CD206阳性细胞百分比显著减少（P＜0.01），提示拟神经炎症反应的BV2细胞向M1型炎症表型极化。与模型组相比，模型+ICA 5 μmol·L-1组CD16/CD32阳性细胞百分比无明显变化，CD206阳性细胞百分比明显增加（P＜0.05）；模型+ICA 10和20 μmol·L-1组 CD16/CD32阳性细胞百分比减少（P＜0.01），CD206阳性细胞百分比显著增多（P＜0.01），提示拟神经炎症反应的BV2细胞向M2型极化。

Fig.1 Effect of lCA on percentage of M1 and M2 types BV2 cells of MANF model detected by immunofluorescence staining.See Tab.1 for the cell treatment.A：the representative fluorescence image of BV2 cell phenotypes，green fluorescence represents CD16/CD32 positive cells and red fluorescence represents CD206 positive cells；B1（the percentage of CD16/CD32 positive cells）and B2（the percentage of CD206 positive cells）were the semi-quantitative results of A.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with model group.

2.3 lCA对MANF模型NLRP3炎症小体相关蛋白表达的影响

Western印迹结果（图2）显示，与细胞对照组相比，ICA组NLRP3、ASC、胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶原1蛋白表达均无明显变化；模型组NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1蛋白表达增多（P＜0.05，P＜0.01），胱天蛋白酶原1蛋白表达明显减少（P＜0.05）；与模型组相比，模型+ICA 5，10 和 20 μmol·L-1组NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1蛋白的表达均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），胱天蛋白酶原1表达无明显改变。

Fig.2 Effect of lCA on protein expressions of Nod-like receptor family protein 3（NLRP3），apoptosis-associated speck-like protein（ASC），procaspase 1 and caspase 1 in MANF model detected by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.IA：integrated absorbance.B1，B2，B3 and B4 were the semi-quantitative results of A，respectively.±s，n=4.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 讨论

炎症因子的过表达是脑炎症损伤病理的经典特征，其中CCL11吸引免疫细胞到炎症反应部位[22]，IL-3和IL-5刺激参与T细胞和B细胞增殖和分化[23-24]，IL-17可促使IL-6和细胞黏附分子1等炎症因子的合成和释放[25]，从而使炎症反应持续。本研究用LPS联合IFN-γ诱导BV2细胞，构建MANF模型。研究结果表明，与细胞对照组相比，细胞+ICA组细胞上清中IL-3，IL-5，IL-17和CCL11水平无明显变化，模型组均显著升高；ICA 20 μmol·L-1可使MANF模型细胞上述细胞因子水平明显降低，提示ICA可抑制BV2细胞神经炎症反应。

正常情况下，小胶质细胞处于静息状态。神经系统受到内在或外来炎症损伤初期，小胶质细胞向M2型极化以发挥抗炎保护作用；随着损伤程度加深，小胶质细胞则表现向M1型促炎表型极化，进一步加深神经系统炎症。CD16/CD32是促炎型小胶质细胞M1型表型标志物，CD206是抑炎型小胶质细胞M2型表型标志物。本研究结果表明，与细胞对照组相比，ICA对BV2细胞CD16/CD32和CD206阳性细胞百分比无明显影响；MANF模型组CD16/CD32阳性细胞百分比明显增加，CD206阳性细胞百分比显著减少，提示MANF模型细胞向M1型炎症表型极化。与模型组相比，ICA 10和20 μmol·L-1可使MANF模型细胞CD16/CD32阳性细胞百分比明显减少，CD206阳性细胞百分比显著增加，表明ICA可使MANF模型细胞向M2型抗炎表型极化。

MS进程中存在NLRP3炎症小体的激活。炎症发生初期，小胶质细胞呈现M2型，此时NLRP3激活以抵御外界炎症损伤，维持中枢功能平衡；疾病后期，NLRP3大量激活，M1型小胶质细胞占主导地位。NLRP3炎症小体是以NLR3蛋白为受体蛋白、胱天蛋白酶作为效应蛋白（effector）、ASC为接头蛋白的复合体。炎症发生时，炎症因子分泌增多可刺激NLRP3和ASC表达增加，使胱天蛋白酶原1转为成熟的胱天蛋白酶1，进一步加重炎症反应。本研究结果表明，与细胞对照组相比，ICA对BV2细胞NLRP3、ASC、胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶原1蛋白表达均无明显影响；模型组NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1蛋白表达增多，胱天蛋白酶原1蛋白表达明显减少；ICA 5，10 和 20 μmol·L-1可使 MANF模型细胞NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1蛋白表达减少，提示ICA发挥抗炎作用可能与其抑制NLRP3炎症小体相关蛋白表达有关。

综上所述，ICA可明显改善LPS和IFN-γ联合诱导的MANF模型细胞炎症反应，有较好的抑制神经炎症的作用。据报道，ICA可通过靶向核因子E2相关因子2信号通路抑制小胶质细胞介导的神经炎症反应[18]。因此，需开展动物实验研究，对ICA改善神经炎症反应的作用机制进行深入探索。