用于转化生长因子 β/Smad信号转导通路抑制剂筛选的慢病毒报告载体的构建

杨翠平，何 园，刘慧莹，张 硌，周晨辰，米志强，查玉华，柏长青

（1.解放军医学院，北京 100039；中国人民解放军总医院第五医学中心南院区 2.呼吸与危重症医学科，3.医学工程科，北京 100071；4.军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071）

转化生长因子β（transforming growth factor-β， TGF-β）是一个由多种分泌型多肽信号分子组成的细胞因子超家族，调节机体的多种生物学功能。Smad蛋白在TGF-β的胞内信号转导中起关键作用，是目前发现的唯一一个TGF-β受体胞内激酶底物，可将TGF-β信号由细胞膜外直接转导入细胞核，TGF-β/Smad信号转导通路在生物体的胚胎发育、成体组织再生及内环境稳态中均发挥重要作用[1]。Smad 蛋白是TGF-βⅠ型受体（TGF-β receptorⅠ，TβR-Ⅰ）的直接作用底物，从结构和功能上主要分为3个亚型：① 受体调节型Smad（receptor-activated Smad，R-Smad），包含5个成员：Smad 1，2，3，5和8；② 共同通路型Smad，哺乳动物中只有Smad 4，与其他Smad的同源性较低，参与所有TGF-β超家族的信号转导，C端功能域无磷酸化位点，不与受体直接作用，与R-Smad形成稳定的异源多聚体进入细胞核；③抑制型Smad，包含Smad 6和7，通过阻断R-Smad磷酸化，对TGF-β信号转导通路发挥负调控作用[2]。TGF-β/Smad信号转导通路中各型Smad分子之间的作用精密协调，共同完成生理及病理状态下TGF-β的生物学效应[2]。研究TGF-β/Smad信号转导通路的具体作用机制对阐明肺纤维化等疾病发生机制及筛选药物治疗靶点十分重要，亦有助于进一步探索Smad蛋白在多细胞生物体结构的发育和维持中发挥的调节作用[3]。

红色荧光蛋白mCherry和荧光素酶报告基因载体具有操作简便、易于观察、灵敏度高、稳定性好等优点。本研究构建一种以Smad响应元件（Smad response elements，Smad RE）作为转录调控顺式元件、以GalVP64为放大调控因子、以mCherry或荧光素酶为报告基因的表达载体，并进一步构建由TGF-β诱导表达mCherry或荧光素酶的人非小细胞肺癌A549细胞系，通过观察mCherry或荧光素酶的表达筛选TGF-β/Smad信号转导通路相关抑制剂。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和主要仪器

A549细胞（人非小细胞肺癌细胞系）和293FT（人肾上皮细胞系）及慢病毒质粒载体pCDH-GFPPuro-noCMV由本实验室保存；UAS-Smad REPmin-Gal4VP64-mCherry和UAS-Smad REPmin-Gal4VP64-luciferase报告基因序列由通用生物系统（安徽）有限公司合成，报告基因序列中的Smad RE参照Dennler等[4]设计，序列为：5′-TCGAGAGCCAGACAAAAAGCCAGACATTTAGCCAGACAAAAAGCCAGACATTTAGCCAGACAAAAAGCCAGACATTTAGCCAGACAAAAAGCCAGACATTTAGCCAGACAC-3′；EcoRⅠ和BamHⅠ限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、PCR反应试剂及3.1NEB缓冲液（美国NEB公司）；感受态细菌DH5α、质粒提取试剂盒及DNA电泳凝胶回收试剂盒〔天根科技生化（北京）有限公司〕；脂质体lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；胎牛血清和DMEM高糖培养基（美国Gibco公司）；TGF-β受体拮抗剂LY2109761和SB431542、兔抗人Smad2/3和磷酸化Smad2/3（phospho-Smad2/3，p-Smad2/3）多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；小鼠抗人GAPDH单克隆抗体（美国Santa Cruz Biotechnology）；辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG多克隆抗体（二抗）（美国Jackson公司）；RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂（北京索莱宝科技有限公司）；ECL发光试剂盒和重组人TGF-β（美国Thermo Fisher Scientific公司）；荧光素酶检测试剂盒（美国Promega公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 重组慢病毒质粒pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase的构建和鉴定

首先用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ分别酶切pCDH-GFP-Puro-noCMV慢病毒质粒载体及UAS-Smad RE-Pmin-Gal4VP64-mCherry和UAS-Smad RE-Pmin-Gal4VP64-luciferase报告基因序列，使它们线性化后通过T4 DNA连接酶将该载体分别与UAS-Smad RE-Pmin-Gal4VP64-mCherry和UAS-Smad RE-Pmin-Gal4VP64-luciferase报告基因序列连接（图1），分别获得由TGF-β诱导的含有Smad RE和mCherry或荧光素酶报告基因序列的重组慢病毒质粒载体，分别命名为pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase。将该2个重组慢病毒质粒分别转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞扩增，随后挑取单克隆、酶切和测序，鉴定重组慢病毒质粒pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase是否构建成功。

Fig.1 Schematic diagrams of construction of recombinant lentiviral plasmid vectors—pCDH-USPG-mCherry and pCDH-USPG-luciferase recombinant lentiviral plasmids induced by transforming growth factor- β（TGF- β），which contained Smad response elements（Smad RE）and mCherry（red fluorescent protein）or luciferase sequences,respectively.

1.3 慢病毒包装

取对数期生长状态良好的293FT细胞，接种于60 mm×15 mm皿中，37℃，5% CO2培养箱内培养，当细胞汇合度达到60%～70%时开始转染。1个目标质粒：pCDH-USPG-mCherry或pCDH-USPG-luciferase，4 μg；2个辅助质粒：pMD2G 1 μg，psPAX2 3 μg。首先用Opti-MEM 100 μL分别稀释2个辅助质粒和1个目标质粒，轻轻吹吸3～5次混匀；其次用Opti-MEM 100 μL 稀释 16 μL LipofectamineTM2000，轻轻吹吸3～5次混匀，室温下静置5 min；随后混合转染试剂和质粒DNA稀释液，轻轻吹吸3～5次混匀，室温下静置20 min；最后将转染复合物加入到293FT细胞培养皿中，前后轻摇培养皿混合均匀。转染6 h后更换新鲜培养基，48 h后收集细胞上清液1次；加入新鲜培养基继续培养，72 h后再次收集细胞上清液。将2次收集的上清液合并，300×g离心5 min去除残余细胞。用0.22 μm的滤器过滤后，4000×g离心 20 min得到病毒浓缩液约 200 μL，-20℃保存备用。

1.4 慢病毒感染A549细胞

以每孔3×104～5×104A549细胞接种于6孔培养板，待细胞生长至对数增长期且状态良好时，加入浓缩后的pCDH-USPG-mCherry或pCDH-USPG-luciferase病毒液50 μL。感染后约72 h，在450 nm激发光照射下，利用倒置荧光显微镜观察A549细胞是否表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）。随后加入嘌呤霉素5 mg·L-1筛选感染成功的细胞。24 h后更换新鲜培养基，未成功感染的细胞被嘌呤霉素杀死，感染成功的细胞完好，并表达GFP。感染成功的细胞分别命名为USPG-mCherry A549和USPG-luciferase A549细胞，扩大培养后备用。

1.5 倒置荧光显微镜观察USPG-mCherry A549细胞mCherry的表达

取稳定感染的USPG-mCherry A549细胞加入24孔板，在37℃，5% CO2及饱和湿度条件下培养，待细胞汇合度达约80%时进行实验。实验分为细胞对照、TGF-β（终浓度 10 μg·L-1）、LY2109761（终浓度5 μmol· L-1）、SB431542（终 浓 度 10 μmol· L-1）、LY2109761+TGF-β和SB431542+TGF-β组，其中LY2109761+TGF-β和SB431542+TGF-β组先分别加入 LY2109761（终浓度 5 μmol·L-1）和 SB431542（终浓度10 μmol·L-1）预孵育1 h，然后加入TGF-β（终浓度10 μg·L-1）。各组继续培养24 h后，通过倒置荧光显微镜观察各组细胞mCherry的表达。

1.6 荧光素酶检测试剂盒检测USPG-luciferase A549细胞荧光素酶的表达

取稳定感染的USPG-luciferase A549细胞加入24孔板中，在37℃，5% CO2及饱和湿度条件下培养，待细胞汇合度达约80%时进行实验。实验分为细胞对照、TGF-β（终浓度 10 和 50 μg·L-1）、LY2109761（终浓度 5 μmol·L-1）+TGF-β（终浓度10 μg·L-1）和 SB431542（终浓度 10 μmol·L-1）+TGF-β（终浓度 10 μg·L-1）组，其中 LY2109761+TGF-β和SB431542+TGF-β组先加入LY2109761和SB431542孵育1 h，然后加入TGF-β。各组继续培养24 h后裂解细胞，使用Tanon 5200化学发光成像分析系统拍摄荧光图像，并利用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的表达。

1.7 Western印迹法检测A549细胞中Smad2/3蛋白磷酸化水平

将A549细胞接种于24孔培养板中，在37℃，5% CO2及饱和湿度条件下培养，待细胞汇合度达约80%时进行实验。实验分为细胞对照、TGF-β（终浓度 1，5 和 10 μg·L-1）、LY2109761（终浓度5 μmol·L-1）、SB431542（终 浓 度 10 μmol·L-1）、LY2109761（终浓度 5 μmol·L-1）+TGF-β（终浓度为 1，5和10 μg·L-1）和 SB431542（终浓度10 μmol·L-1）+TGF-β（终浓度为1，5和10 μg·L-1）组。① 细胞对照组用DMEM培养基培养；②LY2109761+TGF-β和SB431542+TGF-β组先加入LY2109761和SB431542孵育0.5 h，然后加入TGF-β。各组继续培养1.0 h后去除细胞培养基，用预冷的PBS洗2次，加入RIPA裂解液（RIPA裂解液中加入10%的PMSF，现用现配）裂解细胞；然后加入等体积2×蛋白上样缓冲液，于98℃水浴锅中15 min，使细胞充分裂解；6400×g离心2 min，上清用BCA法进行蛋白质定量后制成上样液。各样品取等量蛋白质上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白，随后电转移至NC膜。5%的脱脂牛奶室温封闭1 h，与1∶1000稀释的一抗工作液4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶1000稀释的二抗工作液摇床上室温孵育1 h；TBST洗3次，每次10 min。加入ECL显色液置Tanon 5200化学发光成像分析系统显影，参考蛋白质分子质量标准观察是否有p-Smad2/3蛋白表达。

2 结果

2.1 重组慢病毒质粒pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase的鉴定

构建的重组慢病毒质粒pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase经EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切后经琼脂糖凝胶电泳分离，随后用凝胶成像分析仪观察。如图2所示，pCDH-USPG-mCherry酶切后，可见一条约1690 bp的条带，大小与UASSmad RE-Pmin-Gal4VP64-mCherry序列一致；pCDH-USPG-luciferase酶切后，可见一条约1772 bp的条带，大小与UAS-Smad RE-Pmin-Gal4VP64-luciferase序列一致。选取酶切正确的单克隆菌落进行测序分析，测序结果显示与上述序列一致，表明重组慢病毒质粒载体pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase构建成功。

Fig.2 ldentification of recombinant lentiviral plasmid vectors pCDH-USPG-mCherry and pCDH-USPG-luciferase.A：pCDH-USPG-mCherry vector identification by EcoR Ⅰand BamHⅠenzymes digestion；lane 1：PCR product；lane 2：pCDH-USPG-mCherry enzymes digestion product.B：pCDHUSPG-luciferase vector identification by EcoRⅠand BamHⅠenzymes digestion；lane 1：PCR product；lane 2：pCDH-USPG-luciferase enzyme digestion product.

2.2 转染细胞USPG-mCherry A549和USPG-luciferase A549的鉴定

用浓缩的含pCDH-USPG-mCherry或pCDHUSPG-luciferase的病毒液感染A549细胞，72 h后用倒置荧光显微镜在488 nm激发光照射下可观察到被感染的A549细胞表达GFP（图3），表明A549细胞被感染成功，分别命名为USPG-mCherry A549和USPG-luciferase A549细胞。

Fig.3 ldentification of USPG-mCherry A549 and USPG-luciferase A549 transfected cells（×100）.A549 cells were infected with concentrated virus fluids containing pCDH-USPG-mCherry or pCDH-USPG-luciferase（namely USPG-mCherry A549 and USPG-luciferase A549 cells，respectively）.The expressions of green fluorescent protein in USPG-mCherry A549 cells and USPG-luciferase A549 were observed under excitation light at 488 nm under an inverted fluorescence microscope.

2.3 TGF- β及其受体拮抗剂对USPG-mCherry A549细胞mCherry表达的影响

如图4所示，USPG-mCherry A549细胞对照组及单独加入LY2109761或SB431542组未检测到mCherry的表达；TGF-β组mCherry的表达较细胞对照组明显增强，分别加入LY2109761和SB43154后mCherry的表达较TGF-β组明显减弱。上述结果表明，受Smad调控表达mCherry的USPG-mCherry A549细胞可用于筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂。

2.4 TGF- β及其受体拮抗剂对USPG-luciferase A549细胞荧光素酶表达的影响

如图5所示，USPG-luciferase A549细胞对照组荧光素酶的表达在基线水平，几乎不表达；与细胞对照组相比，加入TGF-β（10和50 μg·L-1）刺激后荧光素酶表达明显升高，分别为细胞对照组的3.55和 3.76 倍；而 LY2109761+TGF-β（10 μg·L-1）和SB431542+TGF-β（10 μg·L-1）组荧光素酶表达较 TGF-β（10 μg·L-1）组又明显减弱，仅为 TGF-β（10 μg·L-1）组的约1/3。上述结果表明，受Smad调控表达荧光素酶的USPG-luciferase A549细胞可用于筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂。

Fig.5 Effect of TGF- β and its receptor antagonists on luciferase expression of USPG-luciferase A549 cells detected by luciferase detection kit.See Fig.4 for the cell treatment.A：pseudo-color image of cell luminescence imaging；B：luminescence imaging of cells；C：the relative expression level of luciferase was normalized by the cell control group.

2.5 TGF- β及其受体拮抗剂对A549细胞Smad2/3蛋白磷酸化的影响

如图6所示，细胞对照、LY2109761和SB431542组A549细胞未见p-Smad2/3蛋白表达；加入TGF-β（1，5和10 μg·L-1）刺激后，均可检测到p-Smad2/3蛋白表达；预先加入LY2109761或SB431542，TGF-β（1，5和10 μg·L-1）诱导的p-Smad2/3蛋白表达则被明显抑制。上述结果表明，Smad2/3蛋白磷酸化被LY2109761或SB431542阻断，LY2109761和SB431542对TGF-β/Smad信号转导具有明显的抑制作用。

Fig.6 Effect of LY2109761（A）and SB431542（B）on expression of phosphorylated of Smad2/3 proteins（p-Smad2/3）in A549 cells by Western blotting.LY2109761+TGF-β and SB431542+TGF-β groups were pre-incubated with LY2109761 or SB431542 for 0.5 h，and then incubated with TGF-β for another 1.0 h.

3 讨论

TGF-β/Smad信号转导通路构成了一个多功能性的细胞因子网络，调控细胞周期、增殖、分化、黏附、转移和凋亡[5-6]。Smad 蛋白是TGF-β超家族细胞内重要的信号转导和调节分子[7]，通过调节该信号通路中一系列下游基因的活性，参与人类多种疾病如纤维化、炎症、自身免疫性疾病和肿瘤等的发生与发展[8]。阻断TGF-β/Smad信号传导可对与其相关疾病的发展起到抑制作用。据文献报道，一些小分子抑制剂如LY2109761和SB431542可抑制该信号通路转导[9]，因此被广泛应用于与TGF-β/Smad信号转导相关的实验研究中。

mCherry是一种来自于蘑菇珊瑚（mushroom corals）的红色荧光蛋白，能在特定波长激发时发出红色荧光[10]。相对于其他荧光蛋白，mCherry的优越性在于它可与应用较多的GFP共同标记，且荧光非常稳定。荧光素酶是能催化荧光素或脂肪醛氧化产生生物发光的一类酶，是一种常用的报告基因，因其具有非放射性、灵敏度高、操作简便、结果准确、无毒副作用等优点，在药物筛选领域已成为一种非常重要的研究工具[11-14]。

本研究利用DNA重组技术成功构建pCDHUSPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase 2个重组慢病毒报告基因载体，在293FT细胞中包装出慢病毒感染A549细胞，利用倒置荧光显微镜观察到被感染的A549细胞表达GFP，表明表达mCherry和荧光素酶的USPG-mCherry A549和USPG-luciferase A549细胞构建成功。加入TGF-β后可观察到USPG-mCherry A549细胞表达mCherry，USPG-luciferase A549细胞表达荧光素酶；而加入TGF-β受体拮抗剂LY2109761和SB431542后，mCherry和荧光素酶的表达被抑制，表明本研究构建的慢病毒表达载体可成功响应与TGF-β/Smad信号转导通路相关的信号刺激。

最后，为初步探讨LY2109761和SB431542在TGF-β下游Smad2/3蛋白信号转导中的抑制作用，本研究用A549细胞检测其阻断Smad2/3蛋白磷酸化的作用。结果表明，LY2109761和SB431542可特异性阻断A549细胞Smad2/3蛋白磷酸化，对TGF-β/Smad信号转导具有明显的抑制作用。

综上所述，本研究构建了pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase 2个慢病毒报告基因载体，通过观察mCherry荧光蛋白或荧光素酶的表达可鉴别目的细胞对TGF-β/Smad信号通路的响应，而且结果稳定，操作简便，可直接用于以TGF-β或其受体家族为靶点的药物筛选和活性检测。