液相色谱-串联质谱法测定猪组织中58种兽药残留

熊增星，刘青，连琦，张文中，胡文斌*

1.江西省食品检验检测研究院（南昌 330001）；2.上海爱博才思分析仪器贸易有限公司（上海 200233）

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈、正己烷（色谱纯，德国Merck公司）；乙酸铵（分析纯，德国Merck公司）；试验用水为GB/T 6682《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水；标准溶液混标（1.0 mg/mL，天津阿尔塔科技有限公司）；实际样品来源于超市和农贸市场。

1.2 仪器与设备

API 6500+四极杆串联线性离子阱质谱仪（美国 AB SCIEX公司）；SIL-30 AC 220V高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司）；IKA T18数显型高速分散机（德国IKA公司）；HITACHI CR22N高速冷冻离心机（日本HITACHI公司）；N-EVAP112型氮吹浓缩仪（美国Organomatian公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

将多种兽药混标溶液（1.0 mg/mL）用甲醇稀释成1.0 μg/mL的混合标准工作溶液。吸取适量混合标准工作溶液，用基质空白溶液配成质量浓度为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 ng/mL的系列标准工作溶液，临用现配，所有溶液放置于-18 ℃避光保存。

1.3.2 样品前处理

称取5.00 g样品，置于50 mL离心管中，加入10 mL 80%乙腈水溶液，按12 000 r/min均质提取2 min后，在振荡器上振荡10 min；按8 000 r/min冷冻离心10 min，转移上清液于50 mL离心管中，重复提取1次，合并上清液，待净化。

采用QuEChERS对样品净化，取10 mL上清液加入到QuEChERS兽残净化小管中，涡旋混匀，按4 000 r/min，离心5 min，取5 mL上清液，于40 ℃氮气吹干，用1 mL初始流动相溶解，过0.22 μm微孔滤膜，上机测定。此次研究采用空白基质加标样品比较4种不同净化方式的净化效果。

1.3.3 仪器条件

一段时期以来，各地各级公安机关反馈认为，不少公安类警察高校毕业生入警工作后，角色进入慢、适应能力不强，警务一线中所需要的实践、实战应用能力存在诸多不足之处。而制约这一问题的主要瓶颈在于警察高校在应用型人才的培养方面尚存短板，尤其是实验教学管理方面普遍存在不重视、不规范、随意性大等问题，整体把控意识不强、力度不够，实验、实训教学所必需的较为规范严谨的基本管理体系尚未形成乃至实现。

1.3.3.1 液相色谱条件

Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱，柱温30 ℃；进样量2 μL；流速0.3 mL/min；流动相A为0.1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸铵），流动相B为乙腈。梯度洗脱条件：0～1.5 min，99% A；1.5～10 min，99%～70% A；10～18 min，70%～20% A；18～21 min，20%～10% A；21～23 min，99% A。

1.3.3.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源（electrospray ionization source，ESI）；扫描模式为正离子模式扫描；多反应监测采集方式（multiple reaction monitoring，MRM）；气帘气压力40 psi；离子源温度550 ℃；喷雾气40 psi；辅助加热气40 psi；碰撞气：9 psi；电喷雾电压5 500 V，质谱参数见表1。

2 结果与分析

2.1 质谱和色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

试验考察Waters C18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）、Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Waters Acquity UPLC HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）对58种兽药的分离效果。结果发现Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱分离效果明显，峰形较好，没有拖尾现象。混合标准溶液的分离色谱图见图1。因此，选择Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）作为分离柱。

图1 混合标准溶液的MRM色谱图（100 ng/mL）

2.1.2 质谱条件优化

以流动注射方式在正离子模式下对58种化合物混标溶液（100.0 ng/mL）进行母离子（Q1）全扫描，确定各目标化合物的母离子，对母离子进行二级质谱扫描（MS2），对去簇电压、碰撞电压等参数进行优化，每个化合物选择2对响应值高的特征离子对作为定量及定性离子对，优化后的质谱参数见表1。液相色谱分离中采用乙腈和0.1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸铵）作为流动相，通过对梯度洗脱优化，使目标化合物得到较好的分离，混合标准溶液的分离色谱图见图1。

表1 58种化合物的多反应监测（MRM）质谱采集参数及基质标准曲线、相关系数、检出限、定量限

2.2 样品前处理方法的选择

2.2.1 提取溶剂的选择

对于猪组织中多类兽药残留的同时检测分析，提取溶剂的选择最关键。在选择提取溶剂时，要考虑目标物在溶剂中的溶解度、溶剂与基质的浸透效果等因素。常用的提取溶剂有乙腈[7-9]、乙腈水溶液[10-11]、乙酸乙酯[12]、二氯甲烷、甲醇以及水的缓冲盐[13]。样品经乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇提取后溶液中油脂含量较多，且杂质去除效果不好，难控制[14]。乙腈是一种极性溶剂，当用其作为提取溶剂时，能够避免样品中的脂肪也被过多提取，同时对蛋白质沉淀也起到很好效果。一定比例的水相调整乙腈极性可以同时兼顾多种极性不同的目标化合物。由于净化步骤选用固相萃取，若水相含量过高，则可能会使目标化合物在固相萃取中被吸附，影响回收率，且后续氮吹浓缩过程也可能会受到影响[15]。综合多种因素考虑，试验选择80%乙腈水溶液作为最佳提取溶剂。

2.2.2 净化方式的优化

试验通过空白样品在5.0 μg/kg水平下加标回收，比较HLB、QuEChERS、PRiMEHLB、正己烷除脂4种净化方式对猪肉、猪肝、猪肚3种基质中58种化合物回收率的影响，如图2所示。结果表明：与其他3种净化方法相比，样品经QuEChERS净化后，3种基质回收率在80%～110%的兽药数量最多，分别为24，44和38种；低于60%或超过120%的兽药数量相对较少，只有3，1和5种，显示出较好的回收率效果。HLB净化方式在猪肝、猪肚基质中的回收率与QuEChERS相当，而在猪肉基质的回收率稍差一些；PRiMEHLB和正己烷除脂净化方式相对较差。实际试验中HLB净化方案操作繁琐、费时，因此选用QuEChERS净化。

图2 不同净化方式对猪肉、猪肝、猪肚组织中58种兽药的回收率在各区间的分布

接表1

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线、检出限和定量限

在优化的提取、净化和质谱分析条件下，58种化合物在空白样品基质匹配标准溶液中的浓度（1.0～100.0 ng/mL）与对应的峰面积呈良好的线性关系，相关系数均大于0.99。在基质空白样品中，添加一定浓度标准溶液，以定量离子3倍信噪比（S/N=3）计算得58种化合物的检出限分别为0.3～1.5 μg/kg，以定量离子10倍信噪比（S/N=10）得到定量限分别为1.0～5.0 μg/kg，其中红霉素的检出限和定量限分别为1.5 μg/kg和5.0 μg/kg，其他57种化合物的检出限和定量限为0.3 μg/kg和1.0 μg/kg，符合我国对标准曲线、检出限和定量限的要求，可满足日常实验室检测需求，结果见表1。

2.3.2 回收率与精密度

在1.0，2.0和5.0 μg/kg水平上，进行基质加标回收试验，考察猪肉基质的回收率和精密度。按照1.3.2处理样品，各制备6份加标样品，上机测定，结果见表2。平均加标回收率在63.9%～130.6%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，SRSD，n=6）为0.08%～10.15%，方法准确度和精密度满足要求。以60%～120%为标准，有83%种化合物的回收率落在合理范围内，只有少数化合物的回收率小于60%或大于120%，如替硝唑、磺胺嘧啶、恶喹酸、双氟沙星、差向金霉素、替米考星等。考虑到试验方法分析的兽药种类较多，各化合物极性相差较大，对于有少数回收率不好的兽药，属于正常现象[16]。对于回收率不太好的兽药，该方法的检出限低于我国限量标准，所以即使回收率较差也可以保证检出率。

表2 猪肉基质样品中3个浓度下加标回收率及标准偏差（n=6）

接表2

3 结论

试验建立同时测定猪肉、猪肝、猪肚等组织中58种兽药残留量的液相色谱-串联质谱分析测定方法。比较HLB、QuEChERS、PRiMEHLB、正己烷除脂4种净化方式对猪肉、猪肝、猪肚3种基质中58种化合物回收率的影响，最终选取QuEChERS为最佳净化方式。方法仅需1次前处理就可实现对喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类、磺胺增效剂、四环素类、硝基咪唑类、林克胺类、抗病毒类八类兽药残留检测。与国标中按化合物类别分别检测的方式相比，该方法不仅操作简便、检验过程速度快、结果可靠，还节约大量有机试剂，减少人力和时间成本，提高检测效率。该方法在养猪企业、猪肉类生产加工企业、市场监管等部门使用中具有广阔的前景。