响应面法优化超声溶剂法提取甜菊糖苷工艺

陈虎 *，侯丽娟 ，路付勇，李贵祯

1.河北省天然色素工程技术研究中心（邯郸 057250）；2.晨光生物科技集团股份有限公司（邯郸 057250）

甜菊糖学名甜菊糖苷（stevioside），也称甜菊苷，是从菊科植物甜菊（又称甜叶菊）的叶片中提取的食品添加剂，是唯一一种高甜度、纯天然甜味剂，具有安全、低热值和保健作用等优势，应用领域越来越广，发展前景十分广阔，甜菊糖甜度约为蔗糖的300倍[1-4]，且甜味接近蔗糖，产生的热量远低于蔗糖[5]。

国内外提取甜菊糖苷的工艺主要采用热水浸泡法[8-9]，该法简单易行，提取成本较低，因此一直以来被广泛使用。此外，还有水提法、酶法等[10]，但是由于这些传统提取法存在提取时间长、溶剂用量大、原料利用率低等缺点，因此，不少学者对甜菊糖苷的提取进行多方面探索，越来越多新的工艺技术被引进，如超声波提取技术、超临界提取技术、微波提取技术、超高压提取技术等。近年来，利用超声波提取植物中的多糖备受关注[6-7]。试验采用超声波辅助溶剂法，通过响应面法优化工艺参数，旨在探索甜菊糖苷的提取方法，确定合适的提取工艺，为甜菊糖苷的快速有效提取提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜叶菊干叶（晨光生物科技集团股份有限公司）；乙腈（色谱纯）；磷酸二氢钠（色谱纯）；磷酸（色谱纯）；水（GB/T 6682—2008中规定的一级水）；正丁醇（分析纯）；甜菊糖苷标准品：瑞鲍迪苷A含量（质量分数，以干基计量≥99.0%）。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260液相色谱仪（安捷伦科技公司）；R213B旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；SHB-3循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；DK-S24电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；AUY120电子天平（日本岛津）；TH-200BQ数控超声波清洗机（济宁天华超声电子仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 试验方法

甜叶菊干叶→粉碎→过筛→乙醇溶液预浸泡→超声提取→过滤→浓缩→加入7#溶剂→静置→离心沉淀→重相浓缩→加水稀释→甜菊糖萃取液

称取50 g甜叶菊干叶粉碎过0.180 mm（80目）筛子，透过筛孔的粉末放入烧杯中，加入80%甲醇溶液进行预浸泡，浸泡2 h后进行超声提取，设置超声功率90%，连续萃取3次，合并每次萃取液，检测甜菊糖苷含量。

1.3.2 检测方法

萃取液中甜菊糖苷含量的测定，参考GB 8270—2014。

1.3.2.1 色谱条件

色谱柱，C18反相色谱柱，250 mm×4.6 mm，粒径5 μm，或其他等效的色谱柱；流动相，乙腈和磷酸钠缓冲液体积比32∶68；流动相流速1.0 mL/min；检测波长210 nm；进样量10 μL；柱温40 ℃。

1.3.2.2 标准曲线绘制

乙腈水溶液：乙腈和水体积比30∶70；磷酸钠缓冲液（pH 2.6）：称取1.20 g磷酸二氢钠（NaH2PO4），溶于800 mL水中，用磷酸调节至pH 2.6，用水稀释至1 000 mL。

分别称取0.030，0.040，0.050，0.060和0.070 g瑞鲍迪苷A（甜菊糖苷）标准品，于105 ℃干燥2 h，分别置于25 mL容量瓶中，用乙腈水溶液溶解后稀释至刻度，得到RA标准溶液。Y=3 175 152.36X+235.99，R2=0.999 5。

1.3.2.3 产品测定

将甜菊糖苷样品在105 ℃下干燥2 h后称取约0.04 g，置于25 mL容量瓶中，用乙腈水溶液溶解后稀释至刻度，得到试样溶液。经0.45 μm微孔过滤后进样。

1.3.3 甜叶菊糖苷萃取得率计算

式中：甜菊糖含量是指上述方法检测值；10%是指甜叶菊干叶中甜菊糖苷含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声提取次数对甜菊糖萃取得率的影响

确定萃取温度50 ℃、超声萃取时间40 min、料液比1∶6（g/mL），观察不同超声提取次数对甜菊糖萃取得率的影响，试验数据见图1。

图1 超声提取次数对甜菊糖萃取得率的影响

由图1可知，甜菊糖萃取得率随着超声提取次数增加而提高，超声提取次数从1次增加到2次时，甜菊糖提取得率明显上升，从2次增加到3次时，甜菊糖萃取得率趋于平缓，所以从经济合理性考虑，最佳超声提取次数为2次。

2.1.2 超声提取时间对甜菊糖萃取得率的影响

确定超声萃取次数2次、萃取温度50 ℃、料液比1∶6（g/mL），观察不同超声萃取时间对甜菊糖萃取得率的影响，试验数据见图2。

由图2可知，20～35 min时，甜菊糖萃取得率随着超声提取时间增加而明显提高，35 min之后，随着超声提取时间增加，甜菊糖萃取得率下降。导致这种现象的原因可能是：在20～35 min这段时间里，随着超声时间增加，甜叶菊细胞膜的破碎度逐渐增大，溶出物的含量也随之增多，甜菊糖苷含量增加；随着时间的进一步增加，溶解度达到饱和时，有效成分不再被溶解，得率不再有明显提高；超声时间继续延长，杂质的含量相应增多，有效成分的溶解量随之减少，即甜菊糖萃取得率下降。因此，最佳超声提取时间为35 min。

图2 超声萃取时间对甜菊糖萃取得率的影响

2.1.3 超声提取温度对甜菊糖萃取得率的影响

确定超声萃取次数2次、萃取时间35 min、料液比1∶6（g/mL），观察不同超声提取温度对甜菊糖萃取得率的影响，试验数据见图3。

图3 超声提取温度对甜菊糖萃取得率的影响

由图3可知，提取温度低于50 ℃时，甜菊糖萃取得率随着温度升高而大幅提高，这可能是温度较低时，一部分胞壁结构未受到根本性破坏，而仅发生变形和裂纹，而随着温度的提高，热效应使分子的运动加速，进一步破坏了胞壁结构，从而使甜叶菊中水溶性糖苷得到更充分的释放，温度超过50 ℃后，甜菊糖萃取得率呈现下降趋势。分析原因，可能是温度高于50 ℃后，在高温和超声波的协同作用下，部分甜菊糖苷分解，导致甜菊糖萃取得率下降。所以，最佳超声提取温度为50 ℃。

2.1.4 料液比对甜菊糖萃取得率的影响

确定超声萃取次数2次、萃取时间35 min、萃取温度50 ℃，考察不同料液比对甜菊糖萃取得率的影响，试验数据见图4。

由图4可知，料液比1∶3～1∶5（g/mL）时，甜菊糖萃取得率随着液体比例增加而逐渐提高，料液比1∶5（g/mL）时出现最大值。这是因为随着液体比例增大，萃取液中甜菊糖苷以及杂质含量同时增加，但料液比达到一定值后，杂质的提取效率将明显影响提取物中甜菊糖苷含量，因而最佳料液比为1∶5（g/mL）。

图4 料液比对甜菊糖提取率的影响

2.2 响应面设计试验

2.2.1 Box-Behnken设计方案

在单因素试验结果基础上，选取对甜菊糖萃取得率影响较大的因素，即超声提取时间、超声提取温度、料液比，采用三因素三水平Box-Behnken试验设计进行响应面试验，试验因素与水平设计见表1，响应面分析方案见表2，回归方程各项的方差分析见表3。

表1 试验因素水平表

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken设计模型进行优化试验，以A、B、C为自变量，以甜菊糖萃取得率为响应值Y，结果如表2所示。拟合得到的回归方程为Y=92.12+2.40A+3.74B+0.99C+0.33AB+1.27AC+1.05BC-2.21A2-5.13B2-3.69C2。

表2 Box-Behnken设计方案及响应值

从表3可以看出，模型的显著水平远远小于0.001，说明回归方差模型高度显著，而且失拟误差不显著，表明该模型不存在失拟因素。从表3可以看出，超声提取时间、超声提取温度、料液比对甜菊糖均有高度显著性影响（p＜0.001），其中超声提取温度影响最显著，其次为超声提取时间和料液比。

表3 方差分析表

2.2.2 等高线图和响应面图分析

响应面3D分析图如图5～图7所示，直观反映各因素交互作用对响应值的影响。可以看出，超声萃取时间与超声萃取温度对甜菊糖萃取得率的交互作用不显著，超声萃取温度与料液比交互作用影响明显。由图5和图6可知，料液比和超声萃取温度一定时，甜菊糖萃取得率随超声时间增加先增加后减少。由图5和图7可知，固定料液比和超声时间，甜菊糖萃取得率随超声温度升高先增加后减少，结果与单因素试验结果一致。

图5 萃取时间与萃取温度对甜菊糖萃取得率的影响

图6 萃取时间与料液比对甜菊糖萃取得率的影响

图7 提取温度与料液比对甜菊糖萃取得率的影响

回归模型预测的甜菊糖苷萃取的最佳条件为原料预浸泡2 h，超声功率90%，超声萃取2次，每次超声萃取时间35.84 min，超声萃取温度49.72 ℃，料液比1∶5（g/mL）。此条件下得到的甜菊糖萃取得率理论上可达94.82%。

2.3 验证试验

为检验响应面分析法的准确性，采取上述最优萃取条件对甜菊糖苷的提取进行验证，考虑到在实际操作中的局限，将甜菊糖苷萃取工艺参数调整为原料预浸泡2 h，超声功率90%，超声萃取2次，每次超声萃取时间35 min，超声萃取温度50 ℃，料液比1∶5（g/mL）。在此条件下进行3次平行试验，结果如表4所示。以拟定的条件重复试验3次，甜菊糖萃取得率平均值为95.05%，与预测值基本吻合，说明优化试验方案可行。

表4 试验结果

3 结论

采用超声萃取法萃取甜菊糖，在单因素试验基础上选取试验因素与水平，根据中心组合（Box-Behnken）试验设计原理采用三因素三水平的响应面分析法，得到甜菊糖最佳萃取条件：原料预浸泡2 h，超声功率90%，超声萃取2次，每次超声萃取时间35 min，超声萃取温度50 ℃，料液比1∶5（g/mL）。甜菊糖萃取得率可达95.05%。此次试验结果对甜菊糖萃取的进一步研究提供参考，具有一定实际应用前景。