不同提取方式对冬葵果中咖啡酸、阿魏酸含量的影响

胡 杨，李先芝，2*，石 豪，刘 洋，毛琼丽，严 玲

(1.劲牌有限公司，湖北 大冶 435112；2.中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北 大冶 435112 )

冬葵果为锦葵科植物冬葵(MalvaverticillataL.)的干燥成熟果实，一般于夏、秋季节果实成熟时采收，除去杂质，阴干，冬葵果药材外表黄绿色或黄棕色，具有清热利尿、消肿之功效[1]，该药作为蒙古族常用药，在我国具有悠久应用历史。有研究表明，冬葵果中含有挥发油、多糖、酚酸、黄酮等有效成分[2-5]，而咖啡酸、阿魏酸是冬葵果中主要的酚酸类化合物。现代药理学研究表明，咖啡酸、阿魏酸等酚酸类具有抗病毒、抗氧化、调节免疫力、护肝、抗癌等生物活性[6-13]，因此对冬葵果进行深加工，并对其有效药用成分进行提取，具有广阔的开发利用前景。

《中国药典》是通过测定冬葵果中的总酚酸含量对其质量进行控制，但只介绍了紫外分光光度法，而应用高效液相色谱法同时测定冬葵果中的咖啡酸、阿魏酸的含量未见报道。本研究以冬葵果为原料，分别采用水煮法、醇提法、超声提取法、索氏提取法等几种常见提取方法对冬葵果中咖啡酸、阿魏酸进行提取，并以HPLC法对其进行含量测定，以期找到一种简单且有效的提取方法，为冬葵果的进一步开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 高效液相色谱仪(赛默飞公司，uLtiMate 3000，美国)；电子分析天平(赛多利斯SQP，德国)；数控超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司，中国)；PURELAB-超纯水仪(PURELAB classic UV，英国)；数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司，中国)；索氏提取器(SXT-06，上海洪纪仪器设备有限公司，中国)。

1.1.2 试剂 乙腈(HPLC级，美国费希尔公司)；磷酸(HPLC级，国药集团有限公司)；乙醇(国药集团有限公司，分析纯)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。对照品：咖啡酸(批号：110885-201703，纯度99.7%，中国药品检定研究院)，阿魏酸(批号：110773-201313，纯度99.6%，中国药品检定研究院)。冬葵果样品由劲牌持正堂药业有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 水煮法 准确称取冬葵果粉末0.5 g置锥形瓶中，精密加入蒸馏水20 mL，于80 ℃条件下回流1 h，放冷，用蒸馏水补足减失的重量，取少量过0.45 μm微孔滤膜，即得。

1.2.2 醇提法 准确称取冬葵果粉末0.5 g置加热回流装置中，精密加入50%乙醇20 mL，于90 ℃条件下回流3 h，用50%乙醇补足减失的重量，取少量过0.45 μm微孔滤膜，即得。

1.2.3 超声提取法 准确称取冬葵果粉末0.5 g置锥形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，在250 W、35 kHz、90 ℃条件下超声30 min，用50%乙醇补足减失的重量，取少量过0.45 μm微孔滤膜，即得。

1.2.4 索氏提取法 准确称取冬葵果粉末0.5 g置索氏提取装置中，精密加入50%乙醇20 mL，于90 ℃条件下回流3 h，用50%乙醇补足减失的重量，取少量过0.45 μm微孔滤膜，即得。

1.2.5 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱见表1；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长325 nm。在此色谱条件下记录色谱图。

表1 冬葵果检测流动相洗脱程序

2 结果与讨论

2.1 水煮法条件的确定

因咖啡酸与阿魏酸均溶于热水，故本研究对时间和温度进行优化，选取不同的提取时间和提取温度依次进行试验。结果发现，当温度上升时，咖啡酸、阿魏酸含量也随之增加，但当温度相同时，随着时间的延长咖啡酸的含量逐渐降低，而阿魏酸含量逐渐增加。这可能是由于咖啡酸结构中含有不饱和双键，在水煮条件下容易被氧化，而随着时间的延长冬葵果粉与水分子间的吸附作用被破坏，阿魏酸被释放出来[14-15]。综合考虑，选择编号2，提取温度为80 ℃、提取时间为1 h，可达到综合较优的效果。见表2、图1。

2.2 醇提法条件的确定

由于咖啡酸和阿魏酸含有较多的亲水基，故其可溶于水或者亲水的有机试剂如乙醇。而乙醇是较常用的提取溶剂，故醇提法选择乙醇作为提取溶剂。为了达到最佳的提取效果，本研究采用正交试验对乙醇比例、提取温度和提取时间3个因素分别进行优化，每个因素设3个水平，见表3。通过正交试验结果分析，结果显示提取溶剂乙醇的比例对咖啡酸和阿魏酸的提取效果影响最大，R分别为0.221 2、0.044 7；而提取时间对提取效果的影响最小，R分别为0.057 4、0.016 2。综上，编号3的提取效果最佳，咖啡酸和阿魏酸含量分别为0.193 6 mg/g、0.029 4 mg/g。故最终选择的提取条件为乙醇比例为50%、提取时间为3 h、提取温度为90 ℃。见表3、表4。

2.3 不同提取方式对咖啡酸、阿魏酸含量的影响

在确定了提取溶剂的比例、提取时间、提取温度的情况下，将不同提取方式对冬葵果中咖啡酸、阿魏酸的提取效果进行了比较，结果见表5。由表5可知，醇提法相对于其他方法而言具有较大的优势。因此，选择醇提法作为最终提取方法。

表2 不同提取条件对冬葵果中咖啡酸、阿魏酸含量的影响

图1 同一温度不同时间对冬葵果中 咖啡酸、阿魏酸含量的影响

表3 试验因素水平

2.4 方法学考察

2.4.1 对照品溶液的制备 精确称取咖啡酸8.33 mg、阿魏酸5.98 mg至20 mL的容量瓶中，加甲醇溶解，定容，摇匀，即得咖啡酸浓度为415.250 5 mg/L、阿魏酸浓度为297.804 mg/L的混合对照品母液。

2.4.2 供试品溶液的制备 准确称取冬葵果粉末0.5 g置加热回流装置中，精密加入50%乙醇20 mL，于90 ℃条件下回流3 h，用50%乙醇补足减失的重量，取少量过0.45 μm微孔滤膜，即得。

表4 正交试验结果

表5 不同提取方式对冬葵果中咖啡酸、阿魏酸含量的影响比较 (mg/g)

2.4.3 线性关系考察 将混合对照品溶液母液稀释成5个不同浓度水平的对照品混合溶液，精密吸取5个不同浓度的对照品混合溶液10 μL，注入液相色谱仪，得到各浓度的色谱峰的峰面积，以浓度为横坐标，相对应的色谱峰面积为纵坐标建立标准曲线，得出线性关系及范围。结果见表6。

表6 线性范围

2.4.4 精密度试验 取同一冬葵果样品，按照“2.4.1”项下供试品溶液制备方法制备供试品，按“1.2.5”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，咖啡酸、阿魏酸峰面积的RSD分别为0.42%、1.12%(n=6)，表明该仪器精密度良好。

2.4.5 重复性试验 取同一冬葵果样品6份，按照“2.4.1”项下供试品溶液制备方法制备供试品，按“1.2.5”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，咖啡酸、阿魏酸峰面积的RSD分别为1.61%、1.33%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.4.6 稳定性试验 取同一冬葵果样品，按照“2.4.1”项下供试品溶液制备方法制备供试品，按“1.2.5”项下色谱条件分别在0、2、5、9、13、18 h进样，记录峰面积。结果显示，咖啡酸、阿魏酸峰面积的RSD分别为0.42%、0.48%(n=6)，表明供试品溶液在室温下放置18 h稳定性良好。

2.4.7 加样回收试验 精密称取已知含量的冬葵果样品0.25 g至加热回流装置中，共9份。分别按照冬葵果中咖啡酸、阿魏酸含量的50%、100%、150%共3个水平加入对照品适量，按“1.2.5”项下色谱条件进行测定，咖啡酸、阿魏酸加样回收率结果见表7。咖啡酸与阿魏酸的加样回收率在93.48%～100.95%之间，RSD值小于3%。

表7 冬葵果中咖啡酸、阿魏酸的加样回收率 (n=9)

3 结论

本研究探讨不同提取方法对冬葵果中咖啡酸和阿魏酸含量的影响，结果发现采用醇提法时，咖啡酸与阿魏酸的含量最高，分别达到0.193 6 mg/g、0.029 4 mg/g；其最佳提取条件为：乙醇比例50%，提取温度90 ℃，提取时间4 h。本研究通过HPLC法同时测定冬葵果样品中咖啡酸和阿魏酸的含量，试验结果表明，该方法操作简单、重复性好、准确度高，可用于冬葵果药材中咖啡酸和阿魏酸含量的检测及质量监控。