基于UHPLC-Q-TOF-MS技术研究黄甲软肝颗粒及其中间体物质基础

王彩云，卢敬光，朱国元，张保献，姜志宏，王宗权*，高 进2，*

(1.澳门科技大学 中药质量研究国家重点实验室，澳门药物及健康应用研究院，中国 澳门 999078；2.暨南大学 药学院，广东 广州 510632；3.盈科瑞(横琴)药物研究院有限公司，国家中药现代化工程技术研究中心新型递药系统分中心，广东省雾化吸入制剂工程技术研究中心，广东 珠海 519000)

肝纤维化(Hepatic fibrosis，HF)是一个可逆的过程，中药在抑制肝纤维化进展和促进肝纤维化逆转方面优势独特，许多中药已广泛应用于临床，并取得了一些较好的疗效[1-5]。黄甲软肝颗粒(临床批件号：2010L03749)处方来源于临床，由鳖甲、灵芝、黄芪、丹参、葛根、三七、柴胡、赤芍、鸡骨草、叶下珠等10味中药组成，具有益气疏肝、活血软坚、清热利湿之功。目前，其处于Ⅱ期临床阶段，前期开展并完成了药效学、毒理学等研究，但尚未系统阐述其化学成分和物质基础。

本研究基于UHPLC-Q-TOF-MS技术，对黄甲软肝颗粒及其中间体中的化学成分进行分析，建立了每味药材的化学成分数据库，采用数据库匹配、对照品验证的方式，对检测到的成分进行了鉴定和药味归属，可为工艺生产过程的质量控制、稳定性研究，以及质量标准起草等提供科学依据。

1 实验材料

1.1 仪器

1290型超高性能液相色谱仪-6230 型飞行时间质谱仪(美国Agilent 公司)，AUY220 型1 /1 万电子天平(日本岛津公司)，AB265-S 型1 /10 万电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，Allegra X-15R 型离心机(美国Beckman Coulter 公司)，Milli-Q型超纯水系统(美国Millipore公司)。

1.2 材料与试剂

葛根素对照品(上海同田生物技术有限公司，批号：9020922)；二氢丹参酮Ⅰ(江苏永建医药科技有限公司，批号：YJ140810)；黄芪甲苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、柴胡皂苷A、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、芍药苷、芦丁、芹菜素、原儿茶醛、柯里拉京、鞣花酸、灵芝酸A、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷F2对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为：110781-201717、110745-201619、110703-201529、110704-201625、110777-201510、110766-201721、111562-201716、110736-201842、100080-201811、111901-201603、110810-201608、111623-201002、111959-201602、111985-201601、110754-201626、111818-201603、111764-201602)；没食子酸、绿原酸、隐绿原酸、槲皮素、异槲皮苷、迷迭香酸、丹参素钠、隐丹参酮、20(R)-人参皂苷Rh1对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为：MUST-16022801、MUST-12031401、MUST-12113002、MUST-16031804、MUST-15070211、MUST-12020702、MUST-12080701、MUST-12082909、MUST-14031311)；三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(R)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、七叶胆苷ⅩⅦ、20(S)-人参皂苷Rg3、20(R)-人参皂苷Rg3为实验室自制。乙腈(色谱纯，厂家：ACSchem，USA)，甲酸(分析纯，厂家：德国默克)，水为自制超纯水。黄甲软肝颗粒(批号：20190615)、黄甲软肝中间体(真空减压粉)、鳖甲粉末、灵芝粉末、黄芪粉末、丹参粉末、葛根粉末、三七粉末、柴胡粉末、赤芍粉末、鸡骨草粉末及叶下珠粉末均由盈科瑞(横琴)药物研究院有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 检测条件

2.1.1 色谱条件 Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)，流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B)，洗脱梯度：0～20 min，3%～60%B；20 min～25 min，60%～95%B；25 min～30 min，95%B；30 min～31 min，95%～3%B；31min～35 min，3%B，流速0.35 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量1 μL。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正、负离子模式扫描，扫描范围m/z100～1 700，MS采样速率2 spectra·s-1，干燥气(N2)流速10 L·min-1，干燥气温度325 ℃，喷雾器压力0.28 mPa，毛细管电压3.5 kV，喷嘴电压正离子模式0.5 kV、负离子模式1.5 kV，Agilent MassHunter workstation软件进行数据处理。

2.2 样品溶液制备

2.2.1 黄甲软肝颗粒及中间体供试品溶液 精密称取黄甲软肝颗粒及黄甲软肝中间体各0.1 g，分别加入50%甲醇10 mL，超声处理(功率220 W，频率50～60 kHz)30 min，取出，离心(4 000 r·min-1，10 min)，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 单味药供试品溶液 分别精密称取鳖甲、灵芝、黄芪、丹参、葛根、三七、柴胡、赤芍、鸡骨草、叶下珠粗粉各0.1 g，按“2.2.1”项下方法制备，得各单味药供试品溶液。

2.2.3 对照品溶液 分别取没食子酸、丹参素、原儿茶醛、隐绿原酸、绿原酸、葛根素、柯里拉京、芍药苷、芦丁、鞣花酸、异槲皮苷、三七皂苷R1、迷迭香酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、槲皮素、人参皂苷Rb1、三七皂苷R2、芹菜素、20(S)-人参皂苷Rg2、20(R)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、黄芪甲苷、人参皂苷Rd、灵芝酸A、七叶胆苷ⅩⅦ、柴胡皂苷A、人参皂苷F2、20(S)-人参皂苷Rg3、20(R)-人参皂苷Rg3、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，置于10 mL 量瓶中，加甲醇超声使溶解，冷却至室温后定容至刻度，摇匀，制成10 mg·L-1的对照品溶液。

2.3 质谱数据分析

结合Dictionary of Natural Products(DNP)，ChemSpider，PubChem等数据库中质谱信息以及参考文献[6-41]，建立单味药化学成分数据库，采用Masshunter(B.06.00)软件采集和处理数据，将主要色谱峰的精确相对分子质量与自建的化学成分数据库进行比对，推测各化合物的分子式，结合对照品和单味药质谱信息对色谱峰进行指认和归属。

2.4 化学成分分析

黄甲软肝颗粒及中间体供试品溶液的基峰离子色谱(BPC)见图1、图2。黄甲软肝颗粒共鉴定出126个化学成分、黄甲软肝中间体共鉴定出141个化学成分，共有峰116个，其中35个化合物有对照品验证，并对每个化合物的来源进行了归属(见表1)。按药材归属化学成分鉴定结果统计分析见表2。

注：a.黄甲软肝颗粒；b.黄甲软肝中间体；c.空白。

注：a.黄甲软肝颗粒；b.黄甲软肝中间体；c.空白。

表1 黄甲软肝颗粒及中间体化学成分的UHPLC-Q-TOF-MS鉴定

续表1

续表1

续表1

鳖甲[8-9]的主要成分为氨基酸、核苷、肽及鳖甲多糖，黄甲软肝颗粒与中间体中未找到鳖甲的归属。鸡骨草[10-11]药材主要含有生物碱、蒽醌类及皂苷类等。灵芝[12-13]药材主要含有三萜类和多糖，以及核苷类、甾醇类、生物碱类、多肽。黄甲软肝颗粒和中间体中检出的灵芝成分主要为三萜类。三七[14-20]药材中主要含有皂苷类成分，皂苷类成分在弱酸弱碱低温条件下比较稳定，而在强酸高温下受影响大，且会发生转化，这也解释了黄甲软肝颗粒中一些三七皂苷成分反而在中间体中缺失的原因[8]。丹参[21-24]中有效成分主要有脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类成分，此外还含黄酮类、三萜类和甾醇类等成分。黄甲软肝颗粒和中间体中检出的丹参成分主要为二萜醌类和酚酸类。黄芪[23，25-26]中主要含有三萜皂苷、黄酮类化合物以及多糖。黄甲软肝颗粒和中间体中检出的黄芪成分主要为三萜皂苷和黄酮类。赤芍[27-28]中主要含有萜类及其苷，赤芍中各苷类的总称为赤芍总苷，是其主要有效成分。黄甲软肝颗粒和中间体中检出的赤芍成分主要为单萜类。叶下珠[29-30]中包括黄酮、鞣质、香豆素、甾体、木脂素、三萜、酚酸、有机酸等多种类型。黄甲软肝颗粒和中间体中检出的叶下珠成分主要为黄酮和有机酸。葛根[31-38]中主要含有异黄酮和三萜类，异黄酮是葛根的主要活性成分，包括苷和苷元。黄甲软肝颗粒和中间体中检出的葛根成分，主要为黄酮类。柴胡[39-41]中除含有挥发油和皂苷外，尚含有黄酮、多元醇、植物甾醇、香豆素、脂肪酸等成分。黄甲软肝颗粒和中间体中检出的柴胡成分主要为皂苷。此外，黄甲软肝颗粒中检出了阿斯巴甜辅料。

表2 黄甲软肝颗粒及中间体按药材归属化学成分鉴定结果

3 讨论

(1)本研究对色谱条件进行了优化，考察了不同色谱柱、柱温及洗脱梯度等，最后选择Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)，流动相为0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水系统，柱温35 ℃，药材、中间体及成品的分离效果较好，35个对照品中的同分异构体也得到了较好的分离。

(2)黄甲软肝颗粒复方中成分较多且响应模式不尽相同，正离子模式适用于检测杂原子化合物，负离子模式更适用于多羟基、羧基得到化合物，如三七皂苷类、酚酸类等。因此，本研究采用了2种离子扫描模式(ESI+和ESI-)对黄甲软肝颗粒及中间体的化学成分进行鉴定，成品共鉴定出126个化学成分、中间体共鉴定出141个化学成分，以黄酮、皂苷、酚酸、二萜醌和三萜类为主。皂苷类成分在弱酸弱碱低温条件下比较稳定，而在强酸高温下受影响大，且会发生转化，这也解释了黄甲软肝颗粒中一些三七皂苷成分反而在中间体中缺失的原因。成品中鉴定的化学成分略少于中间体，可能是工艺生产过程中，化合物不稳定造成，也可能是成品中这些化合物的峰面积低于检测限而被忽略。

(3)鳖甲的主要成分为氨基酸、核苷、肽及鳖甲多糖，核苷类是具有广泛生理活性的一类水溶性成分，多糖具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂、抗氧化及抗衰老等多方面作用。黄甲软肝颗粒与中间体中未找到鳖甲的归属，这应该与检测方法、色谱柱的选择有关，本研究选用的C18色谱柱因其疏水性结构对多糖等成分保留效果较差。

(4)本研究建立了基于UHPLC-Q-TOF-MS技术的分析方法，对中药复方制剂黄甲软肝颗粒及其中间体的化学成分进行了系统分析，结合自建数据库匹配，对照品验证的成分鉴定方法，所鉴别的化合物可全面反映黄甲软肝颗粒的化学物质基础，本研究对黄甲软肝颗粒的研究开发、质量控制和临床应用具有重要参考意义。