分步酶解制备乳清蛋白源ACE 抑制肽的工艺研究

范尧珠，李倩茹，王雪峰,2，普岳红,2，李凌飞，黄艾祥

(1.云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201；2.云南省畜产品加工工程技术研究中心，昆明 650201）

0 引言

乳饼作为云南特色产品之一，其制作过程中会产生大量的乳清水，乳清水具有很高的营养价值和保健功能[1-4]，但这些乳清水未得到充分利用，造成了浪费。因此，如何提高乳清水的利用率成为亟待解决的问题。

高血压是一种慢性疾病，如今，高血压患者人数已突破1 亿[5-8]。常见的高血压药物大多是化学合成的，具有一定的毒性，影响身体健康[9]。食品源血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Enzyme,ACE）抑制肽是理想的高血压治疗药物[10]，且多项研究表明，乳蛋白源是ACE 抑制肽的一个重要来源[11-12]。

本研究以乳清水为原料，采用双酶分步酶解乳清蛋白制备ACE 抑制肽，以蛋白水解度和ACE 抑制率为评价指标，通过单因素和响应面优化实验确定最佳酶解条件，以期为乳源ACE 抑制剂的研究开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

HHL（马尿酰-组氨酸-亮氨酰）、胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶，上海源叶生物科技有限公司；血管紧张素转化酶（ACE），美国Sigma-Aldrich 试剂公司；木瓜蛋白酶，江苏锐阳生物科技有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠、盐酸、氯化钠，天津市风船化学试剂科技有限公司。

H3-18K 台式高速离心机，湖南可成仪器设备有限公司；JC-SY 恒温水浴锅，上海成顺仪器仪表有限公司；BSA124S-CW 电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；STARTER3100pH 计，奥豪斯仪器（上海）有限公司；R-BIOPHARMWELI 酶标仪，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳清蛋白粉的制备

原料的制备参照雷静[13]的方法。

乳清水→用10 mo l/L 的NaOH 调pH 至7.5 →按照12 mL/L 的量添加浓度为1 mol/L 的CaCl2（目的是沉淀酪蛋白）→在60 ℃水浴搅拌15 min→离心(4000 r/min,4 ℃，35 min) →取上清液→粗滤→微滤→超滤→透析→冻干→乳清蛋白粉

1.2.2 乳清蛋白源ACE 抑制肽的酶解制备工艺流程

乳清蛋白粉→按照料液比加蒸馏水配成溶液→震荡5 min→调到酶的最适pH→水浴酶解（酶解过程中保持酶解的pH 值）→95 ℃酶失活10 min→离心（4000 r/min,30 min）→酶解液

1.2.3 酶解产物水解度的测定

水解度参照吕小京等的OPA（邻苯二甲醛）法[14]进行测定。向96 孔板中依次加入酶解液和OPA 试剂，在25 ℃左右震荡8 min 后,在340 nm 处测定吸光值。以GSH（谷胱甘肽）为标准品绘制肽含量标准曲线为标准，将吸光度代入公式求出样品中的多肽含量，蛋白含量用凯氏定氮法测定值为68.7%。水解度计算为

1.2.4 ACE 抑制率的测定

采用紫外分光光度法[15]。用pH 值为8.3，含浓度为0.3 mol/L 的NaCl（PBS）溶液将HHL 固体配置成浓度5 mmol/L 的溶液，首先把马尿酸和酶解液混合在37 ℃条件下预热5 min，然后加入标品，在相同温度下继续反应30 min，之后立马加入盐酸终止反应。最后加入适量的乙酸乙酯提取反应物中的马尿酸。用离心机离心10 min，转速为4000 r/min 后取300 μL上清液于另一离心管中，120 ℃烘干，取出冷却到常温后加入0.6 mL 超纯水，在228 nm 处测定吸光度。ACE 抑制率为

式中：Aa为样品组；Ab为对照组；Ac为提前终止反应组。具体步骤如表1 所示。

表1 体外ACE 抑制率测定方法 μL

1.3 酶解条件

1.3.1 酶的筛选

酶具有专一性，酶的类别不一样，获得的酶解产物的特性不同。采用碱性、胃、胰和木瓜蛋白酶进行实验。根据水解度和ACE 抑制率，确定出最佳的两种酶。

1.3.2 单因素实验

在分解阶段选择了两种酶，以温度50 ℃，酶解时间2.5 h∶2.5 h，料液比1∶30 为初始条件，研究酶解温度（40，45，50，55，60 ℃）、酶解时间(1 h∶4 h，2 h∶3 h，2.5 h∶2.5 h，3 h∶2 h，4 h∶1 h) 和料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50）对水解度和ACE 抑制活性的影响，确定出各个因素的最适条件。

1.3.3 响应面优化实验

根据单因素实验得到的结果，运用响应面软件进性进行了三因素三水平的设计来优化工艺条件，得出酶解的最佳工艺条件，如表2 所示。

表2 响应面因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 酶的筛选

由于不同蛋白酶作用底物的酶切位点及水解方式不同，酶解出来的片段的结构和活性也不相同，因此，选取合适的蛋白酶是制备目标肽的重要因素[16]。由图1可知，水解度由大到小依次为碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞胃蛋白酶；ACE 抑制率也呈相同趋势，因此确定将碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶用于后续实验。

图1 不同蛋白酶对水解度及ACE 抑制率的影响

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比对酶解产物水解度及ACE 抑制率的影响

以温度50 ℃，酶解时间2.5 h∶2.5 h 为初始条件，探究料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50）对酶解产物水解度及ACE 抑制率的影响，实验结果如图2 所示。

由图2 所示，随着比例的不断增大，ACE 抑制率和水解度所成趋势大致相同。当ACE 抑制率达到峰值（84.44%）时，相应的料液比为1∶30，随着蒸馏水量的增加，降压活性和水解度呈下降的趋势，ACE 抑制率和水解度呈向下降的趋势，这可能是因为植物蛋白中含有植物蛋白酶抑制剂，能与蛋白酶作用与底物共享蛋白酶的结合基团，表现出竞争性抑制作用[17]，因此可以确定酶解的最佳料液比为1∶30。

图2 料液比对乳清蛋白酶解产物水解度及ACE 抑制率的影响

2.2.2 酶解时间对产物水解度及ACE 抑制率的影响

以酶解温度50 ℃，料液比1:30 为初始条件，探究酶解时间（1 h∶4 h，2 h∶3 h，2.5 h∶2.5 h，3 h∶2 h，4 h∶1 h）对酶解产物水解度及ACE 抑制率的影响，实验结果如图3 所示。

图3 酶解时间对乳清蛋白酶解产物水解度及ACE 抑制率的影响

实验采用碱性蛋白酶先酶解一段时间后再加入木瓜蛋白酶的顺序进行分步酶解，由图3 可知，ACE 抑制率先升高后降低，酶解时间（碱性蛋白酶∶木瓜蛋白酶）为3∶2 时，ACE 抑制率达到峰值87.9%，这时的水解度也比较高。当酶解时间大于3∶2 时，活性肽链被过度酶降解，结构被破坏，并且酶产物的抑制活性降低[18]。因此，可以初步确定最佳的酶解时间（碱性蛋白酶∶木瓜蛋白酶）为3∶2。

2.2.3 酶解温度对水解度及ACE 抑制率的影响

以料液比1∶30，酶解时间2.5 h∶2.5 h 为初始条件，探究酶解温度（40，45，50，55，60 ℃）对酶解产物水解度及ACE 抑制率的影响，实验结果如图4 所示。

由图4 可知，抑制活性和酶解程度的变化趋势相似。当温度为50 ℃时，水解度和抑制活性最好，随着温度的升高，抑制活性和水解度下降，因为每种酶都有特定的耐受温度值，当温度超过了它原本所能承受的温度时，酶的活性反而会受到抑制而降低，影响了酶促水解的速率[19]，由此可以确定50 ℃为最适的酶解温度。王晟等[20]研究发现木瓜蛋白酶制备山杏源降糖肽的最佳酶解温度为50 ℃，与本研究相似。

图4 酶解温度对乳清蛋白酶解产物水解度及ACE 抑制率的影响

2.3 响应面设计及结果

在筛酶试验和单因素试验的基础上，采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对乳清蛋白进行分步酶解，酶的添加量为4%，根据响应面Box-Benhnken 原理，选取料液比、酶解时间和酶解温度为考查因素，ACE 抑制率（Y）为响应值进行优化实验，实验结果如表3 所示，方差分析如表4 所示。

表3 响应面试验设计与结果

表4 回归模型与方差分析

所得数据通过DesignExpert8.0.6 软件逐步回归分析，得到ACE 抑制率与温度、时间和料液比拟合后的二次多项回归方程为

由表4 可知，该模型P<0.0001，说明分布酶解乳清蛋白制备ACE 抑制肽回归模型显著,同时失拟项不显著，R2=0.97 表示模型可信度高，可用该模型来分析和预测整体实验结果。由表4 中X1、X2、X3的F 值大小可以推断出，3 个因素对酶水解产物抑制活性的影响顺序为X1>X2>X3，即料液比>酶解时间>酶解温度，其中X1和X2的影响对于ACE 抑制率更为重要。ACE 抑制率与各因素呈明显的线性关系，通过分析可以得到酶解过程的最佳参数。

分析料液比(X1)、酶解时间(X2)、酶解温度(X3)对ACE 活性的影响情况，3 个因素之间两两交互作用下的三维图和等高线如图5 所示。

图5 各因素及交互作用对ACE 抑制率的影响

通过DesignExpert8.0.6 软件分析及预测，得到最优酶解工艺参数为酶解温度50 ℃，酶解时间3∶2，料液比1∶35（g/mL），在此参数条件下所得酶解产物的ACE抑制率达到88%，与预测值87.69%接近。

3 结论

本实验以从云南乳饼加工副产物—乳清水中获得的乳清蛋白粉为原料，采用单因素实验和响应面分析法优化了分步酶解乳清蛋白制备ACE 抑制肽的工艺，获得其最佳酶解条件为温度50 ℃，时间（碱性蛋白酶∶木瓜蛋白酶）3∶2，料液比1∶35（g/mL），在此条件下酶解液的ACE 抑制率为88%。研究可为后续乳清蛋白源ACE 抑制肽的进一步分离鉴定奠定基础，为相关功能性食品的开发提供重要参考。