达格列净改善2型糖尿病小鼠心肌损伤互作分子网络研究

张 鑫， 桑占发， 于海波， 宋海旭， 梅 竹， 刘 晶， 闫承慧

1.北部战区总医院 心血管内科，辽宁 沈阳 110016；2.解放军32295部队检验病理科，辽宁 辽阳 111000

糖尿病是一种发病率极高的慢性疾病[1]，主要病理分型为Ⅰ型(胰岛素依赖型)和Ⅱ型(非胰岛素依赖型)糖尿病，前者是由于胰岛β细胞失去功能导致胰岛素缺乏而引起血糖升高，后者是由于各种因素引起胰岛素信号异常、使外周组织对胰岛素的敏感性下降而使葡萄糖吸收功能下降或缺失，最终导致血糖升高[2]。目前，由于各种环境因素和长期不良的生活习惯而引起的代谢综合征进展成为Ⅱ型糖尿病约占全部糖尿病患者的90%以上[3]。无论是Ⅰ型还是Ⅱ型糖尿病，长期持续的高血糖会引起各种并发症，包括大血管病变(如冠心病、高血压、动脉粥样硬化、心肌病变等)和微血管病变(肾病、视网膜病变、神经病变、肝病变等)。其中，糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一种独立于高血压、冠心病、动脉粥样硬化等症状的由高血糖和/或高血脂等因素直接引起的心脏疾病，50%以上的糖尿病患者最终死于DCM导致的心力衰竭[4-5]。有效抑制DCM发生和进展是降低糖尿患者病死率的重要手段[6]。达格列净是SGLT2抑制剂类降糖药[7]，SGLT2是钠-葡萄糖协同转运蛋白，属于溶质载体家族5(solute carrier family 5，SLC5)，因此SGLT2又称为SLC5A2，位于近端肾小管S1/S2段的刷状缘膜上，负责90%以上葡萄糖的重吸收。达格列净通过抑制肾小管上皮细胞中SGLT2的功能，抑制尿糖吸收，从而降低血糖[7]。目前，有研究报道，达格列净还具有良好的心肾保护作用[8-9]。但其作用机制尚不明确。本研究应用高脂饮食(high fat diet，HFD)喂养方式建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型，并给予达格列净干预观察小鼠心功能的改变，进而通过基因组学大数据和生物信息学分析尝试寻找其作用通路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本研究所用实验动物均为无特定病原体级，C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，并在北部战区总医院全军重点实验室动物实验中心饲养。本研究经北部战区总医院实验动物伦理委员会批准认可。

1.2 糖尿病心肌损伤小鼠模型制备 选取20只6～8周龄的C57BL6J雄性小鼠给予HFD(甘油三酯60%)喂养造模。湿度40%～60%，温度20℃～25℃，昼夜节律为12 h/12 h。饲养所用笼具及相关器材均定期消毒，每周定时更换垫料2次。小鼠定期检测体质量、心脏超声和血糖，HFD喂养24周时成模。将成模小鼠随机分成两组，达格列净干预组给予达格列净10 mg/(kg·d)，HFD单独喂养组给予正常饮用水，继续喂养3个月，每个月用心脏超声监测心功能改变情况。成模后，所有小鼠空腹12 h后用异氟烷行全身麻醉，麻醉成功后用无菌手术器械将各脏器组织取材。

1.3 心脏组织标本的收集 分别收集达格列净干预组和HFD单独喂养组小鼠各3只。将小鼠麻醉，采用眼科剪打开胸腔，摘取心脏。应用生理盐水灌注冲洗后，用灭菌卫生纸吸取组织表面附着的水滴。直接将标本放置于含有2 ml TRIzol试剂的15 ml离心管中保存。

1.4 心脏组织石蜡标本制备 横轴切取新鲜的心脏组织在生理盐水中冲洗干净，置于4%的多聚甲醛中固定24 h，流水冲洗2 h，分别在梯度酒精中脱水，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透明，将组织放在50℃～52℃的石蜡Ⅰ中过夜，再在60℃～62℃的石蜡Ⅱ、Ⅲ中浸泡60 min，恢复到室温，即得到包埋好的组织蜡块。

1.5 HE染色 将石蜡切片分别置于二甲苯和梯度酒精中脱蜡后，置于苏木素中10 min，水洗切片；然后置于盐酸酒精中分化30 s，氨水中1 min反蓝，伊红染液中7 min，脱水、透明，中性树胶封片。

1.6 Masson染色 将石蜡切片分别置于二甲苯和梯度酒精中脱蜡后，置于Boucn’s液固定过夜。然后，苏木素中15 min染核，0.5%盐酸酒精分化30 s，0.2%氨水反蓝30 s，滴加1滴HT151染色15 min，磷酸溶液分化1 min，苯胺蓝染色15 min，脱水、透明，中性树胶封片。

1.7 RNA提取 在含有TRIzol的离心管中将心脏组织剪碎后，匀浆机6 500 r/min，匀浆30 s，将匀浆混合液转入新的EP管中，加入400 μl三氯甲烷，剧烈混匀后，4℃下12 000 r/min离心 15 min；分离上层水相中的RNA至新的EP管中后，按照 1∶1比例，加入异丙醇。轻微上下颠倒。室温静置15 min，4℃下12 000 r/min离心15 min，弃上清；加入1 ml预冷的75%乙醇重悬沉淀；4℃下12 000 r/min离心15 min，小心弃上清；加入适量DEPC水溶解RNA。样品总RNA利用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific)定量并经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)检测RNA完整性。

1.8 芯片分析 Agilent Mouse ceRNA Microarray 2019(4×180 K，Design ID：086242)芯片实验以及6个样本的数据分析在博淼生物进行。样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程。首先，总RNA反转录成双链cDNA，再进一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA。标记好的cRNA和芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描得到原始图像。

1.9 统计学方法 采用Feature Extraction软件(version10.7.1.1，Agilent Technologies)处理原始图像，提取原始数据。然后对原始数据进行quantile标准化。标准化后的数据进行过滤，用于比较的每组样本中至少有一组75%的样本标记为Detected的探针留下进行后续分析。用t检验的P值和倍数变化值进行差异基因筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值>2.0且P<0.05，同时，对每组差异筛选结果进行散点图、火山图(对应有生物学重复的分组)和聚类图绘制。对差异基因进行GO和KEGG富集分析[10]，以判定差异基因主要影响的生物学功能或者通路。

2 结果

2.1 两组小鼠心功能损伤改善情况比较 干预3个月后，心功能检测发现，达格列净干预组较HFD单独喂养组小鼠心功能显著改善。组织病理学分析证实，达格列净干预组较HFD单独喂养组小鼠心脏显著缩小，左心室壁厚度降低。WGA染色证实，达格列净干预组较HFD单独喂养组小鼠心肌横截面积减少。Masson染色证实，达格列净干预组较HFD单独喂养组小鼠心肌纤维化程度显著降低。提示达格列净可显著改善小鼠心功能。见图1。

图1 两组小鼠心功能损伤改善情况比较(a.小动物心脏超声；b.心脏左心室射血分数；c.心脏缩短分数；d.心脏大体病理切片HE、WGA和Masson染色)

2.2 实验数据变异情况分析 分别提取达格列净干预组及HFD单独喂养组各3只小鼠心肌组织的mRNA，进行转录组学芯片分析。首先，进行实验数据的变异情况检测。本次检测结果中平均CV值为4.724 7，最大CV值为7.013 4，低于15%的CV值要求，提示芯片实验成功。

2.3 样本相关性与主成分分析 应用Pearson Correlation检验方法评价样本间相关性结果。利用基因的表达量进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，观察样本的分布情况，对样本间的关系和实验设计进行验证，从不同维度展现样本间的关系。相关性和PCA提示，两组样本主成分差异显著，各样本组间具有很好的相关性。见图2。

图2 样本间相关关系与PCA(a.Pearson Correlation检验方法评价样本间相关性；b.样本PCA)

2.4 差异mRNA表达情况分析 根据分组情况对数据进行过滤并根据对应的阈值(差异倍数>2.0，P<0.05)进行差异筛选，达格列净干预组小鼠心肌组织中共获得71个差异表达显著基因，其中，上调表达23个，下调表达48个。进一步利用火山图和散点图进行获得的差异表达基因的分布情况分析，结果同统计分析热图结果一致。见图3。

图3 差异表达基因分析(a.差异表达基因分析；b.火山图分析；c.散点图分析)

2.5 mRNA差异表达基因的富集通路分析 GO富集分析软件证实，细胞浆膜蛋白和细胞连接蛋白在两组心脏组织中存在显著差异。同时，细胞-细胞连接，浆膜固有成分、I-kB/NF-kB炎症信号通路和Toll-样细胞受体通路，是改变较为显著的细胞生物学信号转导通路(图4)。KEGG富集软件分析发现，炎症反应通路，Toll-样细胞受体通路和PPAR通路存在明显的表达差异(图5)。两项分析结果均提示，达格列净干预可能通过心肌细胞膜受体作用于其抗炎调控通路，发挥改善心功能的作用，而细胞连接信号转导通路的改变也提示其作用受体有可能是细胞连接受体或分子。

图4 GO Term分析差异表达基因的细胞学组分、生物学功能和生物活动过程 图5 KEGG分析差异表达基因主要调控的细胞信号转导通路

3 讨论

本研究应用经典的Ⅱ型糖尿病小鼠模型，阐明了达格列净在改善Ⅱ型糖尿病引起的心肌损伤和心功能异常中的差异表达基因及其可能的互作调控网络，这为深入阐明达格列净干预心肌损伤的作用机制研究奠定了实验基础。

本研究结果发现，与HFD单独喂养组比较，达格列净干预组小鼠的心脏超声指标(左心室射血分数和缩短分数)均显著升高，心肌肥大和心肌纤维化现象也明显受到抑制，提示达格列净干预有效的改善了HFD诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠的心功能损伤。同时，应用转录组学分析显示，与HFD单独喂养组比较，达格列净干预组小鼠心肌组织中共获得71个差异表达显著基因，其中，上调表达23个，下调表达48个。并且，通过GO分析和KEGG分析均发现，细胞浆膜蛋白和细胞连接蛋白在两种细胞中存在显著差异。同时，细胞-细胞连接，浆膜固有成分、I-kB/NF-kB炎症信号通路、Toll-样细胞受体通路和PPAR细胞信号通路，是改变最为显著的细胞生物学信号转导通路。达格列净作为SGLT2受体的小分子抑制剂，主要通过抑制葡萄糖和钠离子的转运，改善血糖，减少血容量。但其直接对于心肌细胞保护的作用机制尚不清晰。本研究结果证实，达格列净干预可能通过其他相关膜受体直接影响了心肌组织的I-kB/NF-kB炎症信号转导通路和Toll-样受体信号转导通路，从而通过抑制炎症和免疫细胞调控，改善心肌存活能力，从而改善心功能。

Toll-样受体可识别不同的病原体相关分子模式，并在先天性免疫应答中发挥重要作用，且在炎症、免疫细胞调控、细胞存活和增殖方面起着关键调控作用[11]。Toll-样受体信号转导通路的激活来源于细胞浆Toll/IL-1受体(TIR)的结构域，该结构域与接头蛋白MyD88发生相互作用。经过配体的刺激，MyD88将IL-1受体相关激酶-4吸引到Toll-样受体，进一步激活IKK复合体并导致MAP激酶(JNK，p38 MAPK)和NF-κB的激活[12]。PPAR是由脂肪酸及其衍生物激活的核激素受体，属于核激素受体家族中的配体激活受体[13-14]，同其他核受体超家族一样，是一类配体依赖的转录调节因子，控制许多细胞内的代谢过程，维持代谢稳态和炎症基因的表达[15]。

综上所述，达格列净改善糖尿病心肌损伤是通过抑制炎症分子和上调Toll样受体相关的信号转导通路实现的。进一步通过细胞和动物模型研究进行达格列净调控研究的验证，将有希望深入阐明其对心肌细胞保护的调控作用，为更多的保护靶点研究提供有力的实验研究支持。