脂肪干细胞抑制炎症对缓解兔耳增生性瘢痕形成效果研究

杨玲玲， 黄 悦， 王洪一， 白泽明， 韩子阳， 刘芮嫡， 陶 凯

北部战区总医院 烧伤整形科，辽宁 沈阳 110016

创面愈合的过程需要多种细胞、因子和介质的参与，愈合过程中任何一个阶段发生异常都可能导致瘢痕的形成。愈合过程中的炎症期会有大量炎症因子的释放，炎性细胞通过细胞介质参与炎症反应，诱导成纤维细胞活化，成纤维细胞也会反过来调节细胞因子的表达，进一步参与炎症反应[1]。白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)在炎症期均发挥重要的作用，因此，在增生性瘢痕有关的炎症因子表达的相关研究中，这些因子是研究的重点[2-5]。适度的炎症反应对于创面修复是有利的，但是，炎症反应过度可能诱发增生性瘢痕的产生。目前，有学者提出，抑制炎症反应可能会对增生性瘢痕的治疗发挥一定作用[4]。Xie等[6]研究表明，间充质干细胞具有促进伤口愈合并且减少瘢痕增生的作用，脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)也已经被证明可以参与组织和器官的损伤和修复，具有促进创面愈合的作用。但是，ADSCs对于病理性瘢痕的作用机制目前仍在研究中。本研究通过建立兔耳增生性瘢痕模型，探讨ADSCs是否可以通过抑制增生性瘢痕炎症的发生，发挥抑制增生性瘢痕的作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 兔脂肪源性干细胞提取 选取20只清洁级新西兰大白兔，体质量为2.5～3.5 kg，购自辽宁长生生物技术有限公司，饲养于北部战区总医院的实验动物中心。购入后调整性饲养1周，环境条件为(25℃±1℃)、湿度为55%～65%，饮食、进水均自由。将购买的大白兔分开饲养1周，让其适应环境，然后开始实验。取2只清洁级新西兰大白兔，麻醉后获取兔左侧腹股沟的皮下脂肪组织，用PBS反复冲洗脂肪组织，至无血色为止。将组织装至50 ml离心管中，1 200 r/min离心5 min。弃去油脂层，将脂肪层重新收集至离心管中。使用0.125%浓度的Ⅰ型胶原酶按1∶1比例加入脂肪组织，放入5% CO2培养箱中消化2 h，期间每15 min取出摇匀1次。脂肪消化成黏糊状，1 200 r/min离心15 min。离心后使用生理盐水重悬脂肪细胞，将细胞接种于培养皿内。置于37℃、5% CO2培养箱内孵育培养，取3～7代细胞进行后续实验。

1.2 流式细胞技术检测 取第3代的ADSCs，用1% PBS冲洗2～3次，加入适量0.25%胰蛋白酶消化细胞3～5 min，然后加培养基终止消化。离心(100 g，1 500 r/min，10 min)。弃去上清，加入生理盐水重悬细胞。将细胞(1.0×106个/ml)转入EP管中，每管100 μl，然后加入异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的CD45和CD73及PE标记的抗体CD34和CD90，每管5 μl。对照组加入5 μl相对应的同型对照IgG1-FITC、IgG1-PE，4℃避光孵育30 min。4℃离心(100 g，1 000 r/min，5 min)。弃去上清，生理盐水重悬细胞。利用流式细胞仪检测CD34、CD45、CD73、CD90表面标志物。本实验重复3次，结果取均值。

1.3 兔耳增生性瘢痕模型建立及治疗 分别在18只大白兔双耳腹侧设计4个大小为1.5 cm×1.5 cm的方形切口线，切口间距1.0 cm。常规手术消毒兔耳腹侧，然后行肿胀麻醉液的配置，术区局部麻醉满意后，使用尖刀片沿着已经设计好的切口线将兔耳全层皮肤至软骨膜切开，至软骨表面后进行剥离，然后将全部皮肤和软骨膜逐一去除，切除过程中保持耳软骨的完整。

建模成功后，将大白兔分为对照组(n=9)和治疗组(n=9)。对照组：用 2 ml 注射器，从瘢痕四周正常皮肤约0.4 cm处刺入至瘢痕中央，每点注射0.3 ml生理盐水。治疗组：用2 ml 注射器，从瘢痕四周正常皮肤约0.4 cm处刺入至瘢痕中央，每点注射0.3 ml(1×105个)ADSCs。分别在术后即刻，术后1、3、5周注射4次。分别于术后1、3、5周将每组3只动物处死取材，取材时将瘢痕组织、瘢痕周围部分正常皮肤软组织及其下方的软骨一起切除。每个标本由中轴纵切均分为两等份，一份组织放入10%中性甲醛溶液中固定，一份组织保存于液氮中。

1.4 HE染色 4%甲醇固定标本24 h，冲洗干净后分别用70%～100%浓度乙醇逐一脱去标本中的水；浸蜡，包埋；标本切片，切片厚度5 μm。切片在60℃条件下烘干，二甲苯脱蜡；70%～100%不同浓度乙醇干燥切片；苏木精染色5 min；水清洗后使用伊红进行染色2 min；水漂洗后通过中性树胶封片，显微镜下观察，200倍下拍照。

1.5 酶联免疫吸附试验 将组织匀浆，使用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒按照说明书测定标准曲线后，在450 nm波长下用酶标仪测定光密度值，根据标准曲线计算IL-6和TNF-α的含量。

1.6 实时荧光定量PCR实验 将组织裂解，氯仿抽提去除蛋白和DNA，异丙醇沉淀RNA，乙醇清洗沉淀，DEPC水溶解RNA。根据反转录试剂盒，将RNA反转录为cDNA，使用SYBR试剂盒，在95℃ 30 s、变性95℃ 30s、退火55℃ 30 s、延伸72℃ 30 s的条件下进行实时荧光定量 PCR实验。所用引物包括Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ，COLⅠ)，正向引物：GAGGGCAACAGCAGGTTCACTTA，反向引物：TCAGCACCACCGATGTCCA；α-平滑肌肌动蛋白(alpha--smooth muscle actin，α-SMA)，正向引物：GACAATGGCTCTGGGCTCTGTAA，反向引物：TGTGCTTCGTCACCCACGTA；GAPDH，正向引物：GCACCGTCAAGCTGAGAAC，反向引物：TGGTGAAGACGCCAGTGGA。

2 结果

2.1 脂肪源性干细胞鉴定 与相应的同型对照比较，ADSCs表面抗原CD73(99.9%)和CD90(99.9%)呈阳性表达，而CD34(2.09%)和CD45(1.36%)呈阴性表达，证明脂肪源性干细胞提取成功。见图1。

图1 ADSCs表面抗原标志物的表达

2.2 ELISA测定ADSCs对炎症因子的影响 与对照组相应时间点比较，ADSCs作用1、3、5周时，组织中IL-6的表达均显著下调，TNF-α的表达均被抑制，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、3。

图2 ADSCs对IL-6表达的影响(与对照组比较，①P<0.05) 图3 ADSCs对TNF-α表达的影响(与对照组比较，①P<0.05)

2.3 ADSCs对组织中COLⅠ及α-SMA表达的影响 与对照组相应时间点比较，ADSCs作用1、3、5周时，组织中COLⅠ和α-SMA的表达均显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 ADSCs对组织中COLⅠ和α-SMA表达的影响(与对照组比较，①P<0.05)

2.4 HE染色观察 ADSCs的添加可显著降低组织中炎性细胞聚集的现象，对照组胶原错乱排列的现象比较严重。见图5。

图5 HE染色观察瘢痕组织情况(200倍；a.对照组1周时；b.治疗组1周时；c.对照组3周时；d.治疗组3周时；e.对照组5周时；f.治疗组5周时)

3 讨论

目前，对于病理性瘢痕的形成机制有很多猜想，例如免疫炎症性因素，细胞因子调节异常，细胞基质异常等。有研究报道，抑制细胞的增殖、抑制细胞外基质的沉积、抑制炎症的进展，可能是预防和治疗病理性瘢痕的方法[7]。本研究通过进行兔耳瘢痕实验，探讨ADSCs对兔耳瘢痕中炎症因子的影响，从而探讨ADSCs对增生性瘢痕的可能防治机制。为了鉴定原代培养的ADSCs是否培养成功，本研究采用了流式细胞技术检测细胞表面标志物的表达情况，结果发现，该细胞表面CD73和CD9阳性表达，而CD34和CD45阴性表达，提示ADSCs提取成功。

有研究报道，适当的炎症反应可以促进创面的愈合，但是，如果炎症持续存在或者过度表达，可能会导致细胞外基质大量沉积，进而造成增生性瘢痕的形成[8-9]。Xie等[8]指出，IL-6可吸引中性粒细胞释放炎症介质，TNF-α可促进中性粒细胞黏附于内皮细胞上，刺激局部炎症反应。因此，大量IL-6和TNF-α等炎症因子的存在，使得炎症反应加重，最终诱导增生性瘢痕。本研究结果发现，ADSCs可以显著下调兔耳瘢痕组织中IL-6和TNF-α的表达，由此可见，ADSCs可能通过下调炎症因子的表达发挥抑制增生性瘢痕的作用。

与正常组织相比，增生性瘢痕中COLⅠ表达增多[10-13]。本研究通过实时荧光定量PCR检测发现，ADSCs能够显著下调组织中COLⅠ的表达，进而发挥抑制增生性瘢痕形成的作用。α-SMA可以促进细胞移动和收缩，在创面收缩、瘢痕挛缩等增生性瘢痕病理性形成过程中发挥关键作用。既往研究发现，ADSCs可能通过增加肝细胞生长因子的分泌来介导下调成纤维细胞中α-SMA的表达[11-12]。本研究结果也证明，ADSCs可有效抑制增生性瘢痕中α-SMA的积累。由此可见，ADSCs可以通过下调COLⅠ和α-SMA的表达，改善创面收缩与瘢痕挛缩，从而进一步缓解增生性瘢痕的发生与发展。

综上所述，ADSCs能够通过下调增生性瘢痕中炎症因子的表达，抑制COLⅠ和α-SMA的含量，发挥抑制增生性瘢痕的作用。