FosB与小鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡相关性研究

布雨鑫， 武瀚林， 宋海旭， 刘 丹

1.北部战区总医院 心血管内科，辽宁 沈阳 110016；2.中国医科大学附属盛京医院心血管内科，辽宁 沈阳 110004

心血管疾病是全球疾病发病率和死亡率持续升高的主要原因[1]，中国心血管疾病发病率也处于上升阶段，至2020年冠心病患病人数已高达1 139万人[2]，其中，心肌梗死(myocardial infarction，MI)是常见的心血管死亡原因，严重威胁人类健康。心肌细胞凋亡在MI的发生发展中发挥重要作用。MI后，由于缺血缺氧，心肌组织会出现过度的氧化应激及心肌细胞丢失，特别是心肌细胞的凋亡，触发炎症反应；同时，心脏成纤维细胞转化为心肌成纤维细胞，促进心脏纤维化，最终导致心脏重构和心力衰竭[3]。因此，充分认识MI后心肌细胞凋亡的关键调控分子至关重要。Fos被认为是诱导肿瘤生长的重要调控基因。有研究表明，Fos表达通常早于细胞凋亡，提示Fos可能在细胞凋亡等细胞死亡过程中发挥重要作用[4]。Fos家族包括c-Fos、FosB、Fra1及Fra2，有研究表明，c-Fos在中枢神经系统中可以作为大脑损伤后神经元活动的标志物，在MI诱导的边缘区损伤的神经元中，c-Fos表达也会明显增加[5]，但同家族蛋白FosB在MI心肌损伤中是否发挥作用尚不十分明确。本研究旨在探索MI后梗死边缘区及缺氧刺激后心肌细胞中FosB、凋亡蛋白cleaved caspase3的表达变化，明确FosB表达变化与心肌细胞凋亡的相关性。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 SPF级8～10周雄性C57BL/6J小鼠12只购于江苏集萃药康生物科技有限公司(中国南京)，体质量(20±2)g。小鼠置于SPF级环境中饲养，适应环境7 d，温度为(20℃±2℃)，湿度为(45%±3%)，遵循昼夜节律，小鼠可自由摄食和饮水。小鼠心肌细胞系HL-1购自中国上海通派生物科技有限公司，蛋白裂解液和Trizol购自Thermofisher公司，逆转录试剂和荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂购自Takara公司，FosB抗体购自Abcam公司，cleaved caspase3抗体和GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔二抗购自Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 研究方法

1.2.1 急性MI模型建立 采用随机分组的方法将小鼠随机分为假手术组(sham组)和MI组，每组各6只。MI组采用永久性冠状动脉前降支结扎法构建小鼠MI模型[6]，主要方法步骤如下：将小鼠放置于气体麻醉诱导箱内，4.0%异氟烷下吸入麻醉，然后将小鼠置于手术台上，固定四肢，经鼻吸入1.5%异氟烷维持麻醉状态，去除小鼠左胸毛发，剪开长约1.2 cm皮肤切口，将缝线穿过切口皮肤做缝合前状态，用手术钳分离肋间肌肉，显露心脏，用手挤压将小鼠心脏挤出胸腔，寻找左冠状动脉前降支，用手术针引线结扎前降支。

1.2.2 小鼠心功能测定 MI术后3 d，将sham组和MI组小鼠经异氟烷麻醉，仰卧固定于超声台，调节超声探头角度置左室，在M Mode状态下从左室乳头肌水平二维左室短轴切面分别计算左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

1.2.3 氯化钴缺氧诱导HL-1细胞建立细胞损伤模型 用DMEM培养基对HL-1细胞进行培养，置于培养箱培养24 h。在细胞融合率达到70%时给予氯化钴(CoCl2，400 μM)刺激24 h，建立细胞缺氧模型。未给予CoCl2刺激的细胞作为对照组(CON组)，给予CoCl2刺激的HL-1细胞作为缺氧组。

1.2.4 Western Blot检测FosB和cleaved caspase3蛋白表达 加入适量的蛋白裂解液提取sham组和MI后梗死边缘区的心肌组织蛋白，以及CON组和CoCl2刺激后HL-1细胞的蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，按40 μg蛋白上样量配成蛋白样品。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜，封闭，一抗4℃孵育过夜(FosB、cleaved caspase3、GAPDH一抗按1∶1 000比例稀释)，洗膜，二抗室温孵育1 h，洗膜，ECL化学发光，采用Image J图像处理软件进行灰度值分析。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链式反应检测FosB mRNA水平 采用Trizol法提取细胞和组织总RNA，逆转录获得cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)检测FosB mRNA相对表达量。引物序列：m-FosB-F TTTTCCCGGAGACTACGACTC，m-FosB-R GTGATTGCGGTGACCGTTG，18S-F TTGACGGAAGGGCACCACCAG，18S-R GCACCACCACCCACGGAATCG。

2 结果

2.1 sham组、MI组心功能比较 与sham组比较，MI后3 d小鼠的LVEF和LVFS均显著降低(P<0.05)，表明C57BL/6J小鼠MI模型建立成功。见图1。

图1 MI组和sham组小鼠心功能比较

2.2 sham组、MI组FosB mRNA水平及FosB、cleaved caspase3蛋白水平比较 与sham组比较，MI组3 d时梗死边缘区FosB mRNA水平及FosB、cleaved caspase3蛋白水平均明显升高(P<0.05)。见图2。

图2 sham组、MI组FosB mRNA水平及FosB、cleaved caspase3蛋白水平比较

2.3 CON组、缺氧组FosB mRNA水平及FosB、cleaved caspase3蛋白水平比较 与CON组比较，缺氧组HL-1细胞FosB mRNA水平及FosB、cleaved caspase3蛋白水平均明显升高(P<0.05)。见图3。

图3 CON组、缺氧组FosB mRNA水平及FosB、cleaved caspase3蛋白水平比较

3 讨论

有研究表明，MI后大量心肌细胞丢失(主要形式是心肌细胞死亡)会导致不良的心室重构，最终诱发心力衰竭，严重影响MI预后[7]。心肌细胞凋亡是MI早期心肌损伤调节心肌细胞死亡的主要机制[8]，增加心肌细胞凋亡会加剧MI诱导的左室重塑和心功能障碍[9]，抑制心肌细胞凋亡可减少MI后梗死面积并改善MI后心功能[10]。因此，寻找针对心肌细胞凋亡的预防和治疗靶点对于深入明确MI的发病机制以及MI的防治至关重要。

Fos蛋白家族与Jun组成二聚体，与炎症、损伤、应激等有关，在JNK/MAPK信号的下游发挥作用[11]。有学者认为，FosB是Fos蛋白家族成员之一，是N4BP1的直接mRNA靶标，对于维持角质形成细胞和嗜中性粒细胞的正常功能，以及预防牛皮癣发生非常重要[12]。FosB表达增加与慢性癫痫发作有关[13]。有研究报道，FosB作为慢性神经元激活标志物，在高血压后腹内侧下丘脑激活切片中表达明显增加，FosB表达升高可加重高血压后的心脏重塑[14]。Li等[15]对冠状动脉疾病患者进行了转录组测序，发现FosB是差异表达基因中变化最明显的的基因之一，冠状动脉疾病患者心包脂肪组织中FosB mRNA明显升高。Saddic等[16]在猪的心脏急性或慢性缺血模型中提取T2段胸背角组织检测差异表达基因发现，只有FosB被显著激活，而c-Fos仅在急性模型中显著上调。但FosB在C57BL/6J小鼠MI后梗死边缘区心肌组织中的表达目前尚不清楚。

本研究成功构建了C57BL/6J小鼠MI模型，通过Western Blot和qRT-PCR检测MI后3 d梗死边缘区FosB的表达发现，与sham组比较，MI组3 d时梗死边缘区FosB mRNA水平及蛋白水平均明显升高(P<0.05)。细胞学采用CoCl2刺激HL-1心肌细胞来建立心肌细胞缺氧模型，通过Western Blot和qRT-PCR检测也发现，CoCl2刺激后的HL-1心肌细胞中，FosB mRNA水平及蛋白水平均明显升高(P<0.05)。上述结果提示，FosB在MI中可能发挥重要作用。本研究中，MI后梗死边缘区和CoCl2刺激后的HL-1心肌细胞中凋亡蛋白cleaved caspase3表达也显著升高，且与FosB表达增加具有一定相关性，这提示，FosB可能通过影响心肌细胞凋亡参与MI的发生发展，抑制FosB表达可能是治疗MI的有效靶点。

综上所述，FosB在MI后心肌组织和缺氧后心肌细胞中表达升高，与MI后心肌细胞凋亡存在正相关性。本研究局限性在于，虽然发现了MI后FosB表达增加与心肌细胞凋亡具有一定的相关性，但对于FosB对MI后心肌细胞凋亡的具体调控作用尚不清楚。在今后的工作中应继续深入探讨FosB在MI后心肌细胞凋亡中的作用，争取为研发MI后心肌损伤修复的靶点提供新思路。