负压创面疗法联合富血小板纤维蛋白对难愈性创面治疗效果研究

王 翠， 朱 杰， 诸葛恒艳， 李 宏

解放军联勤保障部队第九〇四医院 1.门诊部；2.神经外科；3.骨科，江苏 无锡 214044

难愈性创面是指临床上经1个月及以上时间正规治疗但仍无愈合倾向，而进入病理性炎症反应状态的创面[1]，通常由机械性创伤、烧伤、感染、压疮、糖尿病和肿瘤切除引起。难愈性创面作为一种慢性创面，常规治疗包括换药和清创，但结果往往难以令人满意。近年来，负压创面治疗(negative pressure wound therapy，NPWT)已成为难愈性创面的一种治疗选择[2]。该疗法通过将吸引装置与特殊的创面敷料连接,使创面保持在负压状态，减少组织水肿和细菌负荷，而且，封闭和稳定的环境有利于肉芽组织的生长[3-4]。富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)是一种自体血液衍生产品。PRF中的细胞因子、生长因子、趋化因子和纤维蛋白通过与成纤维细胞相互作用、促进胶原纤维产生和增加角质形成细胞的迁移来刺激血管生成。本研究通过建立大鼠难愈性创面动物模型，评价NPWT联合PRF治疗难愈性创面的疗效并探讨其可能的机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组与造模方法 选取32只健康的雄性SD大鼠，体质量250～300 g，10～12周龄。参照文献[5]中的方法，将32只大鼠用0.3%戊巴比妥钠(1 ml/100 g体质量)腹腔注射麻醉后，于造模区(腰椎正中偏上)剪毛，用塑料瓶盖在造模区标记造模面积，大鼠皮肤消毒后，沿标记线剪去皮肤、皮下组织至肌筋膜，止血，消毒纱布敷料覆盖创面，即刻肌肉注射氢化可的松琥珀酸钠(8 mg/100 g体质量)，连续注射5 d，每天1次，观察创面未愈合，以连续注射5 d后的创面为实验开始的观察起始创面，即第0天，模拟免疫抑制方法制成难愈性创面模型。

1.2 PRF制备 为了避免免疫排斥，使用自体血制备PRF。心室穿刺后，从大鼠心脏抽取3.5 ml血液，然后，立即转移到离心管中，以3 000 r/min离心10 min。离心后，中间层的凝块包含富含生长因子的PRF。

1.3 动物分组与处理干预 将大鼠随机分为4组，分别为对照组、NPWT组、PRF组及NPWT+PRF组。对照组在创面注射1.5 ml生理盐水。NPWT组创面用负压封闭引流(vacuum sealing drainage，VSD)覆盖并连接到-125 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的吸引器。PRF组仅用PRF覆盖创面。NPWT+PRF组用PRF覆盖创面完毕后，修剪合适大小的VSD覆盖于其上，无菌半透膜密封，安装好VSD后，接负压吸引器。4组大鼠用3 M膜封闭所有创面，并在第4、7天更换敷料。

1.4 创面观察 以第0天为观察起始创面，之后第3、7、14天，分别采集创面的标准化照片。基于标准化照片，使用Image J软件对创面面积进行宏观量化。

1.5 组织形态学观察 在第14天，沿创面表面完全切除肉芽组织和皮肤组织。组织在4%多聚甲醛中保存24 h；然后制备石蜡包埋切片。通过Masson染色观察组织中胶原纤维的变化，光镜下胶原纤维呈蓝色。

1.6 酶联免疫吸附试验 第14天，沿创面表面完全切除肉芽组织和皮肤组织，PBS漂洗后取小组织块使用RIPA裂解缓冲液(Beyotime lns，上海，中国)裂解并提取蛋白，提取离心后的上清液，应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)评估血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)-BB和转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β的水平(R&D 公司，美国)。

2 结果

2.1 各组创面闭合效果比较 14 d内4组创面均未出现感染迹象，且创面面积均随着时间的推移而收缩。在第3、7、14天，NPWT+PRF组的创面面积均小于对照组、NPWT组及PRF组。而且，NPWT+PRF组的创面在第14天几乎闭合。见图1。创面闭合面积的量化结果显示，在第0、3、7和14天，NPWT+PRF组创面的闭合速度明显快于对照组、NPWT组及PRF组，组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图1 难愈大鼠模型全层皮肤缺损的代表性图像(比例尺：10 mm)

图2 在0、3、7和14天，4组创面闭合速度比较(与对照组比较，①P<0.05)

2.2 各组胶原蛋白形成情况比较 在Masson染色中，NPWT+PRF组、NPWT组、PRF组均观察到成纤维细胞，在一定程度上排列有方向性，且NPWT组和NPWT+PRF组的方向性更加一致。此外，与NPWT组、PRF组及对照组比较，NPWT+PRF组胶原纤维蛋白更丰富且更均匀。见图3。

图3 Masson染色显示组织中胶原纤维变化情况[NPWT+PRF组的胶原蛋白(蓝染)比其他3组胶原纤维蛋白丰富且均匀，成纤维细胞(红染)在一定程度上排列有方向性]

2.3 各组肉芽组织中生长因子表达水平比较 ELISA结果显示，第14天，NPWT+PRF组肉芽组织中VEGF、PDGF-BB、TGF-β和bFGF水平均显著高于对照组、NPWT组、PRF组，组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；PRF组中VEGF、PDGF-BB、TGF-β和bFGF的水平均显著高于对照组，组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；而NPWT组只有TGF-β、bFGF水平显著高于对照组，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 第14天各组肉芽组织中生长因子表达水平比较(a.PDGF-BB；b.VEGF；c.bFGF；d.TGF-β)

3 讨论

本研究结果发现，NPWT+PRF的联合治疗方案加速了肉芽的生长和创面的收缩，从而大大缩短了创面的愈合时间。创面愈合传统上分为3个阶段，即炎症、增殖和重塑。上皮化、血管生成、肉芽组织形成和胶原蛋白沉积构成了创面愈合增殖阶段的主要步骤[6]。创面愈合的经典特征是肉芽组织的短暂发育，其支持相邻上皮细胞的快速增殖、迁移和分化。创面内肉芽组织生长过缓或胶原蛋白沉积过少，均会导致创面愈合延迟[7]。位于皮肤边缘的上皮细胞开始增殖并发出突起来重新建立保护屏障，以防止体液流失和细菌进一步入侵，称为“再上皮化”过程[6]。

PRF类似于富血小板血浆(platelet-rich plas ma，PRP)，虽然，PRF无法达到与PRP相同的细胞因子水平，但PRF在制备过程中的缓慢聚合似乎生成了一个与天然纤维蛋白网络非常相似的纤维蛋白网络[11]。这种结构可以促成更有效的细胞迁移和增殖，而且其制备方法简单，无需凝血酶等添加剂，也有利于其临床应用。本研究结果发现，在第14天，PRF组和NPWT+PRF组肉芽组织中仍然可以检测到4种生长因子的水平高于对照组(P<0.05)。PRF形成的网格结构可保护生长因子免受蛋白水解[12]。PRF能够持续稳定地释放多种生长因子[11-12]，如VEGF、PDGF-BB、TGF-β1和bFGF，这些生长因子对于创面愈合至关重要，因为其生物学特性能刺激肉芽生长[13]。VEGF和PDGF-BB是血管生成因子，bFGF和TGF-β是促纤维化因子，二者均能促进肉芽生长。生长因子TGF-β和PDGF在肉芽组织的形成中具有重要作用，可以上调胶原蛋白的产生，而且，PDGF还可以上调成纤维细胞中糖胺聚糖和纤连蛋白的合成[14]。PRF可为细胞粘附、迁移、增殖和分化提供结构化的纤连蛋白[15]。本研究结果还发现，与NPWT+PRF组比较，PRF组缺乏定向机械牵引，不能使胶原蛋白分布更均匀。创面修复基于炎症细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞的增殖和迁移。细胞集体迁移比单细胞迁移更有效，细胞间相互作用为细胞集体迁移提供了重要的生物学基础[15]。

带有多孔泡沫敷料的NPWT将真空均匀分布到创面，主要通过机械力促进创面收缩，并能去除创面周围液体，以及保持创面环境的稳定，一定程度上增加了血管生长因子和促纤维化因子，进而实现血管生成，肉芽组织形成，细胞增殖、分化和迁移等过程[16-17]。有研究报道，NPWT机械力造成的创面收缩，能使成纤维细胞响应趋化信号从周围组织迁移到创面，这对组织修复的增殖阶段很重要[16],显露于NPWT的细胞表现出更高的增殖和迁移率[17]。这些细胞增殖在整个创面床上施加强大的收缩力，从而将创面边缘拉在一起[16]。在Masson染色上，NPWT+PRF组、NPWT组、PRF组均观察到成纤维细胞，排列有一定的方向性，且NPWT组和NPWT+PRF组的方向性更加一致，说明这种方向性排列是由NPWT施加的应变力均匀分布在创面表面，进而使胶原蛋白沉积更加均匀。ELISA结果显示，与对照组比较，NPWT能部分上调促纤维化因子bFGF和TGF-β的表达，而血管生成因子VEGF和PDGF-BB的表达上调不明显。因此，NPWT促进创面愈合可以用创面收缩增加来解释，并且在一定程度上增加了细胞因子的释放。

综上所述，NPWT与PRF联合使用可有效修复创面，加速创面愈合。NPWT可通过宏观变形收缩创面，而PRF可刺激肉芽生长。NPWT与PRF联合使用还刺激了PRF相关的血管生成和促纤维化生长因子的释放，促使胶原蛋白均匀沉积。