绿原酸脱除工艺对葵花蛋白功能性质影响的研究

王志鹏，王璐

(齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

葵花籽是制油工业原料的重要来源之一，用于榨油的葵花籽占总产量的50%～55%[1]，所产生的葵花籽粕多用作生产饲料、葵花蛋白，用部分葵花籽粕代替豆粕生产高附加值的酱油，葵花籽粕酿制的酱油有特殊香气，具有一定的防腐功能，可以减少对供应紧张的豆粕的需求。葵花蛋白的营养结构比例接近人体的需求，不仅没有已知的毒性成分和抗营养因子，而且具有良好的消化率。同时，葵花蛋白具有优异的功能和感官特性，可作为食品工业的风味保持剂。但是在食品加工处理过程中，由于其自身成分的交互作用，影响葵花蛋白的营养功能性质和感官特性，不仅会降低其在人体内的消化率，破坏其稳定性，而且会缩短其储存寿命。如葵花籽中存在壳和多酚，多酚的存在会导致葵花蛋白在碱性条件下提取时发生变色，生成绿色的产物从而影响葵花蛋白的感官特性[2]。多酚的存在不但会与赖氨酸和蛋氨酸等必需氨基酸相互作用，还会抑制蛋白酶活性[3-4]，引起消化不良及胃胀现象，降低葵花蛋白的营养价值，无法满足现代食品开发的需要。

绿原酸作为葵花籽粕中主要的酚类物质，在葵花蛋白提取过程中会与蛋白质产生共价及非共价作用，其共价作用会不可逆地生成CGA-蛋白共价复合物，非共价作用会可逆地生成CGA-蛋白复合物。但绿原酸并不会全部与蛋白质发生反应，在不同的酸碱环境和不同绿原酸与蛋白质的相对浓度条件下，蛋白质与绿原酸结合位点的数目不同，因此在反应体系中会同时存在结合态和游离态的绿原酸。葵花蛋白与绿原酸形成CGA-蛋白复合物后，其平均相对分子质量和分子柔性发生改变，从而影响葵花蛋白的溶解性、乳化性、持水性和持油性[5-6]。因此，进一步探究绿原酸与葵花蛋白的不同结合状态对葵花蛋白功能特性的影响具有十分重要的意义。

本研究采用不同的脱酚方式获得葵花蛋白，并以碱溶酸沉法所得蛋白为对照，系统地研究绿原酸对葵花蛋白功能特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葵花籽仁：齐齐哈尔市甘南县；绿原酸水解酶：日本天野酶制剂株式会社；绿原酸标准品(纯度≥95%)：Sigma公司；大豆油：鲁花，压榨一级；氢氧化钠、盐酸、磷酸、乙腈(分析纯)。

1.2 试验仪器

1260型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；FW80型高速粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；Kjeltec 8200型自动凯氏定氮仪 丹麦福斯公司；S210-K型pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；Alpha 2-4/LSC型真空冷冻干燥机 北京思达兴业仪器有限公司；CF15RX型高速冷冻离心机 Hitachi公司。

1.3 试验方法

1.3.1 不同工艺脱酚葵花蛋白的制备[7]

具体实验参数：

筛选葵花籽：将去皮后的葵花籽放置于50 ℃的烘箱中烘干后脱脂3 h，自然干燥并粉碎得到葵花脱脂粕粉；

提取蛋白：将葵花脱脂粕粉以1∶10(m/V)料水比混合，并加入1 mol/L NaOH至溶液pH为8.5，然后放入水浴锅(50 ℃)中水浴并搅拌2 h。利用离心机(4000 r/min)离心10 min，将上清液倒出并保留，再将沉淀物以1∶8(m/V)料水比洗涤，并重复上述操作，将2次离心出的上清液合并；

脱酚：将葵花脱脂粕粉以1∶5(m/V)料水比混合，将温度升至30 ℃后，加入1 mol/L的HCl至溶液pH为6.5，加入1 U/g的酶，酶解3 h；

酸沉：将1 mol/L的HCl加入到酶解后的溶液中，调节溶液pH至4.5，利用离心机(4000 r/min)离心10 min，保留沉淀；

水洗：将沉淀以1∶10(m/V)料水比洗涤2次，利用离心机(4000 r/min)离心10 min，保留沉淀；

中和：将沉淀以1∶3(m/V)料水比加入去离子水，并加入1 mol/L NaOH至溶液pH为7.0左右；

干燥：利用真空冷冻干燥机将蛋白干燥，从而得到葵花蛋白。

工艺流程见图1。

1.3.2 绿原酸含量的测定

参考GB/T 22250-2008和贾国凯等[8]的方法并稍加修改，利用高效液相色谱仪对绿原酸含量进行测定。

称取0.1 g葵花蛋白置于离心管中，并加入30 mL 70%乙醇溶液，利用超声波提取仪超声提取30 min，利用离心机(3000 r/min)离心10 min，取上清液过0.45 μm水相滤膜待测。

色谱柱为Thermo Hypersil ODS-2 (250 mm×4.6 mm×5 μm)，流动相为0.4%磷酸与乙腈以83∶17体积比混合的溶液，流动相流动速度为1.0 mL/min，等梯度洗脱，色谱柱温度为35 ℃，检测波长为327 nm，进样量为10 μL。横坐标为绿原酸标准溶液的浓度，纵坐标为峰面积，标准曲线公式为y=26.678x-43.18，绘制标准曲线，并计算葵花蛋白中绿原酸含量。

1.3.3 溶解性的测定

参照郭晓歌等[9]的方法，将0.2 g葵花蛋白分散于15 mL 0.05 mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，分别加入1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH至溶液pH分别为2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，7.0，9.0，并定容至20 mL，然后置于水浴摇床振荡30 min，利用离心机(3000 r/min)离心20 min。取上清液，用微量凯氏定氮法测定上清液和蛋白样品中蛋白质含量，计算公式为：

1.3.4 乳化性和乳化稳定性的测定

参照Pearce和Kinsella的方法比浊法[10]。将葵花蛋白加入到0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液中，制成1 g/L的蛋白溶液，然后将大豆油和蛋白溶液按照50∶150体积比进行混合。利用均质机(12000 r/min)将混合溶液均质1 min。分别在均质完成0 min和10 min时在底部取出50 μL的混合液，同时加入5 mL 1 g/L的SDS溶液并搅拌均匀。以1 g/L的SDS溶液为空白参比，在500 nm波长处测定其吸光值，重复测定3次，计算公式为：

式中：EAI为乳化活性指数(m2/g)；T=2.303；A0为均质完成0 min的吸光度值；C为蛋白溶液的浓度(g/mL)；Φ为溶液中油的体积分数，0.25；ESI为乳化稳定性；A10为均质完成10 min的吸光度值。

1.3.5 起泡性和泡沫稳定性的测定

参照Motoi等[11]的方法。将葵花蛋白加入到0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液中，制成1 g/L的蛋白溶液。利用高速组织搅拌机(12000 r/min)将蛋白样品溶液搅拌1 min。利用搅拌后泡沫体积与搅拌前液体体积比，测定蛋白的起泡性FC。利用搅拌后静置30 min的泡沫体积与搅拌后泡沫体积比，测定泡沫的稳定性FS，重复测定3次，计算的公式为：

式中：V0为搅拌后泡沫体积，mL；VL为搅拌前液体体积，mL；V30为搅拌后静置30 min泡沫体积，mL。

1.3.6 持水性和持油性的测定

参照Saetae等[12]的方法。

持水性的测定：称取0.2 g葵花蛋白加入到离心管中，称重为W1，然后将10 mL蒸馏水加入到离心管中并搅拌，静置30 min。利用离心机(5000 r/min)离心30 min，倒出上清液，称重为W2，计算公式如下：

式中：W0为葵花蛋白干重，g；W1为离心管与葵花蛋白重量之和，g；W2为离心后离心管与葵花蛋白重量之和，g。

持油性的测定：称取0.2 g葵花蛋白加入到离心管中，然后将10 mL大豆油(V1)加入到离心管中并搅拌，静置30 min。利用离心机(5000 r/min)离心30 min，将上清液倒进量筒中读数，记为V2，计算公式如下：

式中：W0为葵花蛋白干重，g；V1为大豆油的体积，mL；V2为离心后上清液的体积，mL。

2 结果与讨论

2.1 蛋白样品基本参数的测定

蛋白质样品的各项基本参数是蛋白功能特性指标评定的基础，原料蛋白和不同葵花蛋白产物指标的测定参数见表1。

表1 原料基本成分Table 1 The basic ingredients of different sunflower proteins

2.2 不同脱酚工艺对葵花蛋白溶解性的影响

图2 不同葵花蛋白在pH 2～9的溶解性Fig.2 The solubility of different sunflower proteins at pH 2～9

由图2可知，SFP、DDM-1和DDM-2在pH 4附近溶解性最低。DDM-1和DDM-2的溶解性在pH 2～9范围内始终高于SFP，且DDM-2的溶解性略优于DDM-1。这是由于DDM-1和DDM-2中绿原酸大部分被脱除，其绿原酸的含量分别为SFP的12.5%和10.4%，大大减少了多酚与蛋白质作用形成复合物的机会，并且DDM-2的绿原酸在碱溶酸沉过程前进行脱除，从根本上减少了CGA-蛋白复合物的形成，使DDM-2的溶解性略优于DDM-1。同时，由于在脱酚过程中，葵花蛋白需要进行酶解处理，该过程可能改变了蛋白分子的大小和结构，使亲水基团暴露在蛋白分子表面，对水分子的吸附能力增强，使葵花蛋白的溶解性增强[13]。

2.3 不同脱酚工艺对葵花蛋白乳化性及乳化稳定性的影响

图3 不同葵花蛋白的乳化活性和乳化稳定性Fig.3 The emulsifying activity and emulsifying stability of different sunflower proteins

由图3可知，DDM-1和DDM-2的乳化性均高于SFP，分别为19.85 m2/g和18.65 m2/g，但DDM-1和DDM-2的乳化稳定性均低于SFP。可能是由于在脱酚过程中酶解作用会使蛋白质的分子柔性增大，蛋白分子束缚力降低，端基的极性基团增加，显著提高了葵花蛋白的乳化活性[14-15]。同时，由于DDM-1和DDM-2的绿原酸被脱除，葵花蛋白与酚类作用减弱，使葵花蛋白的平均相对分子质量降低，更容易在界面扩散，降低了界面张力。但SFP中的蛋白与绿原酸作用，使葵花蛋白的平均相对分子质量增加，更容易形成稳定的乳化层，SFP的乳化稳定性最高。

2.4 起泡性及泡沫稳定性

蛋白质的起泡能力主要取决于蛋白质的构象，蛋白在溶于水时，小分子蛋白(肽链)迅速到达内表面，吸附并快速形成疏水层，在蛋白表面形成疏水保护膜，其涉及蛋白内在表面的二级及三级结构。发泡能力在一定范围内与相对分子质量呈负相关，相对分子质量越小的蛋白质发泡能力越好，但超过特定范围时，发泡能力会随相对分子质量的减小而降低[16]。

图4 不同葵花蛋白的起泡性和泡沫稳定性Fig.4 The foamability and foam stability of different sunflower proteins

由图4可知，DDM-2的起泡性显著高于SFP和DDM-1(P<0.05)，为64.66%。这可能是由于DDM-2从根本上减少了绿原酸和蛋白质的共价结合，降低了葵花蛋白的平均相对分子质量，使蛋白质能够快速展开并扩散到界面形成界面膜[17]。同时在脱酚过程中的酶解作用会使蛋白质的分子柔性增大[18]，易附在气液的界面上，界面张力的降低导致了起泡性的增加。

DDM-1和DDM-2的泡沫稳定性显著高于SFP(P<0.05)，分别为82.88%和75.22%。且DDM-1的泡沫稳定性优于DDM-2。这可能是由于在脱除绿原酸的过程中使用的乙醇使蛋白质发生轻微变性[19]，蛋白质重新折叠，使内埋的疏水肽段暴露出来，增加了蛋白质的疏水性，提高了泡沫稳定性。同时，DDM-1的绿原酸在碱溶酸沉过程后进行脱除，其蛋白的平均相对分子质量较DDM-2大，有利于蛋白质的泡沫稳定性[19]，使DDM-1的泡沫稳定性优于DDM-2。

2.5 持水性及持油性

蛋白质的持水性、持油性是食品加工过程中的重要功能特性，如肉制品加工、烘焙和冰激凌等，若应用于风味食品加工中，持油性可以提高蛋白与脂肪的结合能力，改善食品对脂肪的吸收和持油能力。

图5 不同葵花蛋白的持水性及持油性Fig.5 The water holding capacity and oil absorption capacity of different sunflower proteins

由图5可知，未脱酚蛋白质SFP的持水性为2.71 g/g，DDM-1的持水性为2.52 g/g，DDM-2的持水性最低，仅为2.10 g/g。而不同蛋白样品的持油能力差异显著，后脱酚处理的葵花蛋白质DDM-1的持油性最低，为3.39 mL/g，未脱酚葵花蛋白SFP的持油性比DDM-1高70%，先脱酚葵花蛋白的持油性最高，比DDM-1高97%。

蛋白质的持水性和溶解性密切相关，一般来说，溶解性越好，蛋白质的保水性就越差[20]。体系中油与蛋白相互作用的作用力主要是非极性脂肪族链和非极性区域间的作用，如非共价键、氢键和疏水作用力[21]。DDM-1的处理过程对蛋白质构象改变程度最大，致使其持油能力减弱。DDM-2处理过程避免了绿原酸与蛋白质的非共价结合，较好地保护了疏水性氨基酸，蛋白质与小油滴之间的疏水作用力未被破坏，使DDM-2的持油能力提升。

3 结论

不同工艺脱除葵花蛋白中绿原酸对葵花蛋白功能性质的影响显著，脱除葵花蛋白的绿原酸可提升其营养特性和功能特性。从酶的种类看，商品酶对葵花蛋白的脱酚作用显著，此外，从酶的脱酚方式来看，提取蛋白前脱酚DDM-2的功能性优于DDM-1，与SFP相比，脱酚葵花蛋白DDM-1和DDM-2的溶解性、乳化性、泡沫稳定性显著提升。先脱酚葵花蛋白DDM-2的溶解性显著提升，pH为7时的溶解性最高。可以得出在提取蛋白前脱酚可以显著提升葵花蛋白的综合功能性质，本研究结果有助于提升葵花蛋白在食品加工中的应用价值。