葛根芩连汤中小檗碱的中药生物药剂学分类系统属性研究

刘洋+朱美玲+孙慧娟+王子禹+陈江鹏+董月柳+董玲

[摘要] 中药生物药剂学分类系统（CMMBCS）的顶层研究之一是中药复方对单一成分的影响研究，除单成分自身溶解性和渗透性外，需结合复方中多成分环境下其溶解性和渗透性各自提升度来进行分类。该文主要是研究葛根芩连复方中小檗碱的CMMBCS分类属性的变化，即小檗碱在葛根芩连汤中的溶解性和渗透性，考察其在整个复方环境中的变化及分类。采用经典摇瓶法和高效液相色谱法测定其在复方中的溶解度变化，并采用大鼠离体外翻肠囊实验进行小檗碱肠吸收定性，采用在体单向灌流法进行小檗碱肠吸收定量研究，同时和肠道血管并行采血实验进行吸收入血的定性和定量研究。

[关键词] 葛根芩连汤；小檗碱；溶解性；肠渗透性；中药生物药剂学分类系统

Biopharmaceutics classification system of Chinese materia

medica of berberine in Gegen Qinlian decoction

LIU Yang，ZHU Mei-ling，SUN Hui-juan，WANG Zi-yu，CHEN Jiang-peng，DONG Yue-liu，DONG Ling*

（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

[Abstract] One of the top-level researches of biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica （CMMBCS） is the study on single component in compound Chinese medicine. The medicines shall be classified according to its solubility and intestinal permeability， as well as the ascending degree in multicomponent environment. Based on above， we chose berberine as the main object to explore the change rules of its solubility and intestinal permeability in Gegen Qinlian decoction. Shaking flask-HPLC was used to detect the solubility changes of berberine in compounds. The qualitative investigation of berberine in intestinal absorption was measured by everted gut sac， and the quantitative research of berberine in intestinal absorption was measured by single-pass intestinal perfusion experiment， while the qualitative and quantitative research of berberine absorption into blood was measured by in intestinal perfusion with venous sampling experiment.

[Key words] Gegen Qinlian decoction；berberine；solubility；intestinalpermeability；CMMBCS

口服藥物的水溶解性及肠渗透性，是判断其胃肠道吸收效果的2个重要参数，也是生物药剂学分类系统（BCS）对药物进行属性分类的依据[1-2]。药物的 BCS 属性部分决定了这个药物在用药机体中吸收程度，对评价药物的吸收至关重要，不仅对已上市药品的生物利用度-吸收关联分析提供了科学框架，更为新药的开发提供理论依据及数据支撑。鉴于FDA，EMA及WHO将生物药剂学分类系统引入到指导原则中进行药物生物等效性豁免的评价研究，其科学性与适应性近几年在不断地得到印证。目前BCS在不断地完善和发展，也衍生出了其他以不同侧重点进行分类研究的分类系统[3-5]。但BCS针对的是单一成分的化学药品，在中药相关领域的研究甚少。然中药与化药口服吸收的本质和核心是一致的，结合中药自身特点与生物药剂学分类系统的优势，本课题组创新性地提出了中药生物药剂学分类系统（CMMBCS）[6]。并且基于“多成分层次差异比较法”的指导，从单一成分到多成分到整个中药整体进行研究[7-11]。本文在之前研究的基础上，以葛根芩连汤中的小檗碱为主要研究对象，深入到研究单一成分在中药复方环境下的BCS属性变化规律。从而进一步丰富中药生物药剂学分类系统的整体研究，并为其之后的发展提供数据及研究成果的参考及支持。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（SPD-20A型紫外检测器，SIL-20A自动进样器，日本岛津公司）；BT-25S电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；DZKW-4电热恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；KH7200DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；STARTER2100实验室pH计（奥豪斯仪器上海有限公司）；蠕动泵驱动器（BT100-1F，保定兰格恒流泵有限公司）；注射泵（LSP02-1B，保定兰格恒流泵有限公司）；高速冷冻离心机（SIGMA，德国）。

1.2 药物与试剂

盐酸小檗碱对照品（批号110713-201212，中国食品药品检定研究院）；盐酸小檗碱原料（批号130808，陕西中鑫生物技术有限公司）；葛根素对照品（批号110752-201313，中国食品药品检定研究院）；黄芩苷对照品（批号110715-201318，中国食品药品检定研究院）；甘草酸铵对照品（批号110731-201317，中国食品药品检定研究院）；乙腈（色谱级，美国Fisher公司）；葛根、黄连、黄芩、炙甘草药材均购于北京同仁堂，经北京中医药大学王晶娟副教授鉴定为豆科植物野葛Pueraria lobata （Willd.）Ohwi的干燥根、毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.的干燥根茎、唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根及甘草的炮制加工品。磷酸、盐酸、枸橼酸、磷酸氢二钠、氢氧化钠、三乙胺、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾 （AR，北京化工厂）；纯净水（娃哈哈集团公司）。

1.3 动物

SD大鼠，雄性，体重200～250 g，北京维通利华试验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2014-0004。

2 方法

2.1 供试液的配制

2.1.1 小檗碱对照品储备液 精密量取小檗碱对照品溶液用甲醇稀释至刻度，制备浓度为1.0 g·L-1的小檗碱对照品储备液。

2.1.2 葛根芩连汤 取适量葛根-黄芩-黄连-炙甘草（8∶3∶3∶2）加10倍量水，浸泡30 min，煎煮保持微沸30 min，趁热滤过，药渣加入8倍量的水煎煮保持微沸30 min，趁热滤过，合并2次滤液，浓缩并冷至室温，加水定容得葛根芩连汤。

2.1.3 Krebs-Ringer′s营养液（K-R液） 称取NaCl 7.80 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.40 g；加蒸餾水定容至1 000 mL，调节pH到7.39～7.41，放置备用。

2.1.4 灌流液制备 取葛根芩连汤用K-R液稀释至生药质量浓度为40，160，240 g·L-1灌流液。

2.1.5 pH 7.4缓冲液 取磷酸二氢钾6.81 g，加0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液395 mL稀释至1 000 mL，即得。

2.2 葛根芩连汤中小檗碱含量测定方法

2.2.1 色谱条件 Luna C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm，Phenomenex，USA）；检测波长270 nm；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量20 μL；流动相乙腈（A）-水（B，含0.4%磷酸，0.8%三乙胺），梯度洗脱（0～11 min，13%A；11～12 min，13%～17%A；12～17 min，17%A；17～26 min，17%～24%A；26～38.5 min，24%～29%A；38.5～45 min，29%～32%A；45～65 min，32%～68%A；65～75 min，68%～13%A）。

2.2.2 标准曲线制备 精密量取小檗碱对照品贮备液（1.0 g·L-1）制备质量浓度分别为0.200 4，0.400 8，2.004，10.02，20.04，40.08，80.16，120.24 mg·L-1的对照品溶液，精密取上述对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以药物浓度C（mg·L-1）为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。

2.2.3 精密度试验 取葛根芩连供试品溶液，重复6次进样检测，记录峰面积。

2.2.4 重复性试验 配置葛根芩连供试品溶液6份，分别精密吸取上述溶液20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，计算RSD，考察方法的重现性。

2.2.5 稳定性试验 取葛根芩连供试品溶液，分别于0，2，6，12，24 h取样检测，进样量20 μL，记录峰面积。

2.2.6 加样回收率试验 取已知小檗碱浓度的葛根芩连供试品溶液，加入小檗碱对照品，HPLC测指标成分的含量，测加样回收率。

2.3 葛根芩连汤中小檗碱溶解度的测定

按2.1葛根芩连汤制备方法制备生药浓度分别为20，40，160，240 g·L-1的葛根芩连汤，并且调溶液pH至7.4，向其中加入过量的小檗碱，（37±1）℃水溶加热，同时振摇至不再溶解得到饱和溶液。室温下静置，微孔滤膜过滤，得续滤，用相应缓冲溶液稀释到一定浓度。高效液相色谱法测定其平衡溶解度。

2.4 葛根芩连汤中小檗碱渗透性的研究

2.4.1 离体翻转肠囊法肠渗透定性研究 大鼠禁食不禁水12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，打开腹腔，分别迅速取出约（10±2） cm 长十二指肠、空肠、回肠、结肠段。小心剥离肠周围脂肪及肠系膜，用37 ℃生理盐水将肠段冲洗干净。将肠段翻转，使黏膜层在外，浆膜层在内，线结扎肠段。肠囊中注入2 mL空白Krebs-Ringer′s肠营养液。将其移入已有Krebs-Ringer′s 肠营养液的锥形瓶中平衡10 min后将肠囊置于盛有30 mL药液中，置于水浴锅中37 ℃保温，为保持离体肠管的活性，向锥形瓶中持续通氧及二氧化碳混合气体。60 min后取出肠囊内液体并测量肠段长度及内径，0.45 μm微孔滤膜过滤，高效液相进行检测。

2.4.2 在体单向肠灌流肠渗透定量研究 大鼠禁食不禁水18 h，称重，10%水合氯醛麻醉，沿腹中线剪开腹部3～4 cm，分离实验用肠段，各肠段取约10 cm，肠段进口端与注射泵相连，用预热至37 ℃的生理盐水以5 mL·min-1的速度对所取肠道进行冲洗。流速调为0.2 mL·min-1灌流药液，约30 min后吸收达到稳定状态。开始计时，用已知质量的小瓶在出口处每隔15 min收集1次，计算收集前后小瓶质量称量差，同时测定收集液的密度，以此方法对灌流液的体积校正。实验结束后处死大鼠并剪下被灌流的肠段，测量其长度和内径。按2.3.1项下色谱条件测定不同时间段流出药液中盐酸小檗碱含量。

2.4.3 肠道灌流并行采血法肠渗透定性和定量研究 大鼠禁食不禁水18 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，右侧颈静脉插管连接到蠕动泵进行供血。打开腹部，选取肠段，用37 ℃的生理盐水冲洗干净，结扎实验用肠段以外的血管。对所取灌流肠段对应的肠系膜静脉插管，并连接到蠕动泵，收集肠系膜静脉流出血液。肠段进口端与注射泵相连，将注射泵流速调为0.2 mL·min-1，灌流药液，约30 min后吸收达到稳定状态。开始计时收集流出的药液和血液。每隔15 min更换肠液和血液的收集管。采用质量法进行水分校正。试验结束后，用生理盐水冲洗肠段，将所用肠段剪下，测量其长度和内径，并处死大鼠。所取血液样品3 500 r·min-1离心15 min，取上层血浆，加入3倍量的甲醇沉淀蛋白，涡旋2 min，1万 r·min-1离心15 min，取上清液定容至5 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液注入高效液相色谱仪进行检测；灌流液样品经0.45 μm的微孔滤膜过滤，注入高效液相色谱仪进行检测。

2.4.4 数据分析[12] 翻转肠囊法肠渗透性的表观吸收系数Papp计算如下。

Papp=ΔQ/Δt2πrL·C0

其中，C0为小檗碱初始浓度（mg·L-1）；ΔQ/Δt为60 min内肠囊内溶液中小檗碱的量（μg·s-1）；L为肠段长度（cm）；r为肠半径（cm）。

在体大鼠单向灌流中采用质量法校正水分吸收，计算有效渗透系数Peff、肠吸收速率常数Ka和肠吸收分数Fa，如下。

Peff=-Qin·ln（Cout（cor）/Cin）2πrL

Ka=（1-Cout（cor）Cin）QinV

Fa=（1-Cout（cor）Cin）×100%

Cout（cor）=CoutQoutQin

Cout=Mout/Doutt

其中，Qin为灌流液流速（mL·min-1），L为灌流肠段长度（cm）；r为灌流肠段半径（cm）；Cin为灌流液中盐酸小檗碱初始质量浓度（mg·L-1）；Cout（cor）为经质量法校正后的灌流收集液中盐酸小檗碱质量浓度（mg·L-1）；V=πr2L为灌流肠道体积（mL）；Qout为通过灌流液流出的速度（mL·min-1）；Cout为灌流收集液中盐酸小檗碱浓度（mg·L-1）；Mout为灌流收集液质量（g），Dout為灌流收集液密度（g·mL-1），t为取样周期（min）。

肠道灌流并行采血实验采用质量法校正水分吸收，计算有效渗透系数Pblood。

Pblood=ΔMB/Δt2πrLC

C=Cout（cor）-C0ln（Cout（cor）/C0）

其中，ΔMB/Δt是血液样品中盐酸小檗碱物质的量（μg·s-1）；C是灌流肠段内盐酸小檗碱对数平均浓度（mg·L-1）；L是灌流肠段长度（cm）；r是灌流肠段半径（cm）；Cout（cor）是盐酸小檗碱校正后灌流收集液浓度（mg·L-1），C0是盐酸小檗碱初始灌流液浓度（mg·L-1）。

3 结果

3.1 药物浓度的测定

盐酸小檗碱的线性回归方程为Y=95 717X-8 552.9，R2=0.999 1，结果表明，小檗碱在0.200 4～120.24 mg·L-1线性关系良好。本方法测定的精密度及稳定性RSD均小于1.0%。加样回收率99.90%～102.5%，RSD均小于5.0%。

3.2 小檗碱的溶解度

测定不同生药浓度葛根芩连汤中小檗碱的溶解度数据，结果见表1。

由结果可知，小檗碱在不同生药浓度葛根芩连汤中溶解度略有不同，D0计算结果在0.77～0.89，均小于1。但相对于小檗碱单一成分的溶解度而言（D0>1）[11]，在不同生物浓度复方环境下，小檗碱溶解度却由低溶解度提升为高溶解度药物，这表明小檗碱在不同浓度的复方环境下的溶解度对小檗碱在机体中的吸收不会产生影响[13]。

3.3 小檗碱的渗透性

3.3.1 离体翻转肠囊法结果 葛根芩连汤翻转肠囊实验中肠囊中样品测定结果见图1，表明葛根芩连汤中小檗碱能够透过小肠壁吸收。

1.小檗碱（图2同）；A. 对照品；B. 葛根芩连汤翻转肠囊样品；C. 葛根芩连汤K-R液样品。

图1 葛根芩连汤HPLC图

Fig.1 HPLC chromatograms of Gegen Qinlian decoction

3.3.2 在体单向肠灌流结果 不同浓度葛根芩连汤中小檗碱在体单向肠灌流的结果见表2。

结果显示葛根芩连汤中小檗碱的渗透性随着生药浓度的增加而增大，且与小檗碱（80 mg·L-1）黄连水煎液中小檗碱浓度相当时[11]，葛根芩连汤（160 g·L-1）的渗透性较黄连单个药材以及小檗碱单一成分都较大。

3.3.3 肠道灌流并行采血法结果 葛根芩连汤双灌流（代指大鼠肠道灌流并行采血实验）吸收入血图谱见图2，表明小檗碱能经过小肠吸收进入血液。

3种不同生药浓度黄连水煎液双灌流定量结果见表3。

结果显示葛根芩连汤中小檗碱能通过小肠吸收进入血液，小檗碱吸收入血的渗透性随着生药浓度的增加而增大，且与小檗碱（80 mg·L-1）黄连水煎液中小檗碱浓度相当时[11]，葛根芩连汤（160 g·L-1）入血的渗透性增大显著，发生了数量级的变化。

4 讨论

从之前的研究结果可知[11]，小檗碱单一成分的溶解性和渗透性均较低，为BCS第IV类药物，依据CMMBCS分类标准，初步定为CMMBCS-IV类，虽然黄连水煎液中小檗碱溶解性和渗透性有所改变，但提升不显著，初步定为自身溶解性和渗透性差且在单个药材环境下提升不显著的CMMBCS-IV类。而本实验结果显示，葛根芩连汤中小檗碱的生物药剂学分类系统的属性溶解性和渗透性相比较于单一小檗碱和黄连水煎液中的小檗碱都有不同。由溶解度实验可知小檗碱在葛根芩连汤中的溶解度较单一成分及单个药材更大，有质的提升，根据FDA指导原则[13]，葛根芩连汤中的小檗碱为高溶解度药物。由翻转肠囊定性实验可以定性看出葛根芩连汤中小檗碱可以透过肠壁吸收。在体单向肠灌流实验结果显示葛根芩连汤中的小檗碱随着生药浓度的增加吸收速率增大，表明其存在被动扩散。与单一小檗碱（80 mg·L-1）渗透性相比，葛根芩连汤（40 g·L-1）环境下的小檗碱的渗透性有显著性差异，且葛根芩连汤（160，240 g·L-1）环境下的小檗碱的渗透性差异极显著。小檗碱在葛根芩连汤（160，240 g·L-1）环境下的有效渗透系数大于0.2×10-4 cm·s-1，这表明小檗碱在此浓度的复方环境下由难吸收药物转变为易于吸收的药物。在小檗碱浓度相当时，小檗碱在葛根芩连汤（160 g·L-1）、黄连水煎液（3 g·L-1）、小檗碱（80 mg·L-1）下的吸收不同，小檗碱在复方中的吸收>单一药材>单一成分，也阐释了复方用药的合理性。且在葛根芩连汤中小檗碱的肠吸收的渗透系数和吸收入血的渗透系数比较于单一药材和单一成分提高了很多，表明了葛根芩连汤复方环境能够明显促进小檗碱的吸收。考虑到小檗碱在葛根芩连汤中溶解度有质的提升，渗透性虽提升显著，但并未达到药物高渗透性的标准。因此，在葛根芩连汤中，小檗碱属自身溶解性差并且在复方环境下提升较好和渗透性差但在复方环境下提升良好的CMMBCS-Ⅲ类。

对于中药生物药剂学分类系统，研究多成分环境对成分自身溶解性和渗透性的影响是其的主要特点。所以，CMMBCS的研究所用溶解性和渗透性数据必须是在多成分环境下测定的数据。其立论依据是，多成分环境可能改变中药中某些成分自身原来固有溶解性和渗透性，进而改变中药整体乃至复方的生物药剂学属性。但对中药及复方而言，化学成分众多，成分之间还会发生复杂的反应，且很多成分的药理药效机制并未十分清楚，研究困难较大。本文基于CMMBCS进行了初步的探索，为今后中药多成分及复方的研究提供参考依据。

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[責任编辑 孔晶晶]